William Howell Masters wurde am 27. Dezember 1915 in Cleveland, Ohio, als Sohn von Francis Wynne und Estabrooks (Taylor) Masters geboren. Er besuchte die öffentliche Schule in Kansas City bis zur achten Klasse und ging dann auf die Lawrenceville School in Lawrenceville, New Jersey. Im Jahr 1938 erhielt er einen Bachelor of Science vom Hamilton College, wo er seine Zeit zwischen naturwissenschaftlichen Kursen und Sportarten wie Baseball, Football und Basketball aufteilte. Er war auch in der Campus-Debatte aktiv. Er trat in die University of Rochester School of Medicine ein und begann im Labor von Dr. George Corner zu arbeiten, der die Fortpflanzungsorgane von Tieren und Menschen verglich und untersuchte.
Während seines ersten Jahres an der medizinischen Fakultät begann Masters sich für die Sexualität zu interessieren, weil sie die letzte wissenschaftlich unerforschte physiologische Funktion war. Nachdem er kurz bei der Marine gedient hatte, erhielt er 1943 seinen Doktortitel. Masters interessierte sich für die Arbeit von Dr. Alfred Kinsey, einem Zoologieprofessor der Universität von Indiana, der Tausende von Männern und Frauen über ihre sexuellen Erfahrungen befragt hatte. Er entschied sich für ein Fachgebiet, das ihm helfen sollte, sich auf die Erforschung der menschlichen Sexualität vorzubereiten und wurde Assistenzarzt und später Assistenzärztin in der Geburtshilfe und Gynäkologie am St. Louis Hospital und am Barnes Hospital in St. Louis. Außerdem absolvierte er ein Praktikum in der Pathologie an der Washington University School of Medicine. Im Jahr 1947 trat er der Fakultät in Washington bei und stieg vom Dozenten zum außerordentlichen Professor für klinische Geburtshilfe und Gynäkologie auf. Masters forschte auf diesem Gebiet und verfasste Dutzende von Artikeln in wissenschaftlichen Zeitschriften. Eines seiner Interessensgebiete war die Hormonbehandlung und der Hormonersatz bei Frauen nach der Menopause.
Im Jahr 1954 beschloss Masters, dass er bereit war, Forschungen über die Physiologie des Geschlechts zu unternehmen. Er war besorgt, dass die Ärzteschaft zu wenig Informationen über Sexualität hatte, um die Probleme der Klienten zu verstehen. Kinsey hatte sich auf Fallgeschichten, Interviews und Daten aus zweiter Hand verlassen. Masters wagte den nächsten Schritt: Er wollte die menschliche sexuelle Stimulation mit Hilfe von Messtechnik in einer Laborsituation untersuchen.
Masters startete sein Projekt an der Washington University, unterstützt durch ein Stipendium des United States Institute of Health. Zunächst rekrutierte er Prostituierte für seine Studien, fand sie aber für seine Untersuchungen der „normalen“ Sexualität ungeeignet. 1956 stellte er Virginia Eshelman Johnson, eine Soziologiestudentin, ein, um bei der Befragung und Auswahl der Probanden zu helfen. Die Studie wurde über einen Zeitraum von elf Jahren durchgeführt, wobei 382 Frauen und 312 Männer teilnahmen. Das Alter der Probanden reichte von achtzehn bis neunundachtzig und sie wurden für ihre Zeit bezahlt. Masters fand einen vierphasigen Zyklus in Bezug auf männliche und weibliche sexuelle Reaktionen. Um physiologische Veränderungen zu messen, setzte er Elektroenzephalographen, Elektrokardiographen, Farbkinematographie und biochemische Untersuchungen ein.
Masters war sehr vorsichtig und peinlich genau darauf bedacht, die Identität seiner Probanden zu schützen. Im Jahr 1959 schickte er einige Ergebnisse an medizinische Fachzeitschriften, arbeitete aber weiterhin unter relativer Geheimhaltung. Nachdem der Inhalt der Studien durchgesickert war, hatte das Team Schwierigkeiten, Fördergelder zu erhalten, so dass Masters 1964 Direktor der Reproduktionsbiologie-Stiftung wurde, einer gemeinnützigen Gruppe, um private Mittel zu erhalten. Im November desselben Jahres schrieb Dr. Leslie H. Farber, ein angesehener Psychiater aus Washington D.C., einen Artikel in Commentary mit dem Titel „I’m sorry, Dear“, in dem er die „Verwissenschaftlichung“ von Sex angriff. Dieser Angriff war nur der Anfang der Kritik, die die Forschung erhalten sollte.
Im Jahr 1966 veröffentlichten Masters und Johnson das Buch Human Sexual Response. In diesem Buch verwendeten die Forscher eine sehr technische Terminologie und ließen ihr Verlagshaus Little, Brown and Co. das Buch nur bei medizinischen Fachleuten und in Fachzeitschriften bewerben. Nichtsdestotrotz wurde das Buch zu einer populären Sensation und das Team begab sich auf eine Vortragsreise, die sie sofort berühmt machte. Bereits 1959 hatten Masters und Johnson begonnen, Paare als zweigeschlechtliches Team zu beraten. In der Überzeugung, dass es für die Partner angenehmer wäre, mit einem gleichgeschlechtlichen Therapeuten zu sprechen, begann das Team mit der Arbeit an sexuellen Problemen von Paaren. In ihrem zweiten Buch, Human Sexual Inadequacy (1970), behandeln sie Probleme wie Impotenz.
Masters ließ sich nicht lange nach der Veröffentlichung von Human Sexual Inadequacy von seiner ersten Frau, Elisabeth Ellis, scheiden und heiratete Johnson am 1. Januar 1971 in Fayetteville, Arkansas. Im Jahr 1973 wurden sie Co-Direktoren des Masters and Johnson Institute. 1979 untersuchten und beschrieben Masters und Johnson in Homosexuality in Perspective die sexuellen Reaktionen von Homosexuellen und Lesben. Sie behaupteten auch, die sexuellen Vorlieben von Homosexuellen ändern zu können, wenn diese es wollten. Masters unterhielt auch ein biochemisches Labor und erhielt weiterhin Honorare aus einer gynäkologischen Praxis. Er zog sich 1975 im Alter von sechzig Jahren aus der Praxis zurück. 1981 verkauften Masters und Johnson ihr Labor und zogen an einen anderen Ort in St. Louis. Zu dieser Zeit hatten sie fünfundzwanzig Mitarbeiter und eine lange Liste von Therapieklienten.
Eine weitere Kontroverse über ihre Arbeit entstand, als Masters und Johnson 1988 zusammen mit einem Mitarbeiter, Dr. Robert Kolodny, ein Buch verfassten. Das Buch „Crisis: Heterosexual Behavior in the Age of AIDS“ (Krise: Heterosexuelles Verhalten im Zeitalter von AIDS) sagte eine Epidemie von AIDS unter der heterosexuellen Bevölkerung voraus. Einige Mitglieder der medizinischen Gemeinschaft verurteilten die Studie scharf, und C. Everett Koop, der damalige Chirurgische Generalarzt der Vereinigten Staaten, nannte Masters und Johnson unverantwortlich. Vielleicht als Folge der negativen Publicity ging die Zahl der Klienten, die eine Sexualtherapie am Institut suchten, zurück. Anfang 1992 gab Bill Walters, der amtierende Direktor des Instituts, bekannt, dass Masters und Johnson sich nach einundzwanzig Jahren Ehe scheiden ließen – als Grund für die Trennung wurden ihre unterschiedlichen Vorstellungen vom Ruhestand genannt. Masters schwor, dass er sich nie zur Ruhe setzen würde und fuhr fort, am Institut zu sprechen und Vorträge zu halten, zusätzlich zu seiner Arbeit an einem weiteren Buch. Die Scheidung beendete ihre gemeinsame Arbeit an der Klinik.
Für seine bahnbrechenden Bemühungen, die menschliche Sexualität zum Gegenstand wissenschaftlicher Studien zu machen, erhielt Masters 1971 den Paul H. Hoch Award der American Psychopathic Association, 1972 den Preis des Sex Information and Education Council of the United States (SIECUS) und drei weitere prestigeträchtige Auszeichnungen. Er gehört der American Association for the Advancement of Science (AAAS), der American Fertility Society und mehreren anderen medizinischen Vereinigungen an.