Von 1853 bis 1860 war Billroth Assistent in der chirurgischen Klinik von Bernhard von Langenbeck an der Charité in Berlin. Dort war er auch Lehrling bei Carl Langenbuch. 1860 nahm Billroth ein Angebot der Universität Zürich auf den Lehrstuhl für Klinische Chirurgie an und wurde Direktor des chirurgischen Krankenhauses und der Klinik in Zürich. Der Beginn seiner Karriere in der Schweiz war wenig verheißungsvoll: Im ersten Semester seiner Lehrtätigkeit hatte er nur zehn Studenten, und die Einkünfte aus seiner Privatpraxis reichten nach eigener Aussage nicht einmal für die morgendliche Tasse Kaffee. Sein Ruf wuchs jedoch schnell; Billroth hatte eine ansteckende Persönlichkeit, die sowohl Studenten als auch chirurgische Auszubildende in seine Reihen lockte. Er wurde von seinen Studenten geliebt und war ein effektiver Lehrer sowohl für Studenten als auch für Doktoranden. Die Studenten strömten in Scharen zu seinen Vorlesungen, und in Zusammenarbeit mit tatkräftigen Kollegen gelang es ihm, die Medizinische Fakultät in Zürich in nur wenigen Jahren zu einer herausragenden Stellung unter den deutschsprachigen Schulen zu bringen.
Während seiner Zeit in Zürich veröffentlichte Billroth sein klassisches Lehrbuch Die allgemeine chirurgische Pathologie und Therapie (1863). Gleichzeitig führte er das Konzept des Audits ein, bei dem alle Ergebnisse, gute wie schlechte, veröffentlicht wurden, was automatisch zu einer ehrlichen Diskussion über Morbidität, Mortalität und Techniken führte – mit der Folge einer verbesserten Patientenauswahl.
Er wurde 1867 als Nachfolger von Franz Schuh zum Professor für Chirurgie an die Universität Wien berufen und übte dort die Chirurgie als Leiter der Zweiten Chirurgischen Klinik am Allgemeinen Krankenhaus aus. Obwohl er den Grundstein seines Ruhmes in Zürich legte, war es in Wien, einem größeren und auffälligeren Schauplatz, dass er sich als die Macht etablierte, die er in der chirurgischen Welt war. Eine Rede, die er 1875 gegen den Zustrom jüdischer Medizinstudenten hielt, gilt als eines der ersten Ereignisse in der Entwicklung des politischen Antisemitismus in Wien.
Während des Deutsch-Französischen Krieges leistete Billroth im Lazarett in Mannheim und Weißenburg hervorragende Arbeit und behandelte mit aggressiven und ehrgeizigen Operationen eine Vielzahl von schrecklichen Schlachtfeldverletzungen; seine Erfahrungen aus der Kriegschirurgie verarbeitete er in seinen Chirurgischen Briefen aus Mannheim und Weißenburg. Er war von den Schrecken des Krieges so beeindruckt, dass er danach immer ein glühender Verfechter des Friedens war. Am 3. Dezember 1891 hielt er eine Rede über die Versorgung von Kriegsverwundeten, die großes Aufsehen erregte und dazu führte, dass die österreichischen Parlamentskammern große Geldsummen für eine angemessene Versorgung der Verwundeten bewilligten.
Er beschränkte sich nicht nur auf die Chirurgie und forschte intensiv über ein Leiden, das damals viele Chirurgiepatienten betraf: das Wundfieber. Seine Abhandlung über das Wundfieber, „Untersuchungen über die Vegetationsformen von Coccobacteria septica“ (1874), kam zu dem Schluss, dass die Ursache bakteriell war; Billroth setzte in seiner chirurgischen Praxis bald antiseptische Techniken ein, und die Zahl der an Wundfieber erkrankten chirurgischen Patienten ging stark zurück. Nachdem die Gefahr tödlicher chirurgischer Infektionen durch seine und anderer Arbeiten gesunken war, wandte sich Billroth der Chirurgie zu und leistete Pionierarbeit auf dem Gebiet der Veränderung oder Entfernung von Organen, die bis dahin als unzugänglich galten.
Als früher Anwender des „weißen Kittels“ (wie auf dem Gemälde von Seligmann um 1890 Als früher Träger des „weißen Kittels“ (wie auf dem Gemälde von Seligmann um 1890) war Billroth für eine Reihe von Meilensteinen in der Chirurgie direkt verantwortlich: 1872 führte er als erster eine Ösophagektomie durch, bei der ein Teil der Speiseröhre entfernt und die verbleibenden Teile zusammengefügt wurden. 1873 führte er die erste Laryngektomie durch, wobei er einen krebsbefallenen Kehlkopf vollständig entfernte. Er war der erste Chirurg, der ein Rektumkarzinom entfernte und bis 1876 hatte er 33 solcher Operationen durchgeführt. Bis 1881 hatte Billroth die Darmchirurgie fast alltäglich werden lassen. Aber seine berühmteste Leistung ist zweifellos die erste erfolgreiche Gastrektomie bei Magenkrebs. Am 29. Januar 1881 führte Billroth nach vielen vergeblichen Versuchen die erste erfolgreiche Resektion bei Antrumkarzinom an Therese Heller durch, die fast 4 Monate lebte und an Lebermetastasen starb. Er führte diese Operation durch, indem er die größere Krümmungsseite des Magens verschloss und die kleinere Krümmung zum Zwölffingerdarm hin anatomisierte, in einer Operation, die bis heute als Billroth I bekannt ist.
Billroths literarische Tätigkeit war weit verbreitet, die Gesamtzahl der veröffentlichten Bücher und Abhandlungen, deren Autor er war, beläuft sich auf etwa einhundertvierzig. Gemeinsam mit Franz von Pitha arbeitete er an einem Lehrbuch der allgemeinen und speziellen Chirurgie (1882). Zu diesem steuerte Billroth die Abschnitte über Skrofulose und Tuberkulose, Verletzungen und Krankheiten der Brust, Instrumente und Operationen, Verbrennungen, Erfrierungen usw.
Billroth gab seinen rastlosen intellektuellen Geist an zahlreiche angesehene Schüler weiter und schuf so die „Billroth-Schule“ von Nachfolgern. Kein Aspekt seines Berufs schien seiner intensiven Prüfung zu entgehen, sei es in der Forschung, der Lehre, der Verwaltung oder der Krankenpflege. Zu jedem hatte er nicht nur etwas Wertvolles zu sagen, sondern sorgte oft dafür, dass seine Ideen konkrete Realität wurden. In allen Bereichen, die er zu beeinflussen suchte, ließ er sich vom Glauben an die Einheit von Wissenschaft und Kunst leiten und vom Vertrauen in seine eigene Fähigkeit, Veränderungen zu bewirken.
Billroth war maßgeblich an der Gründung der ersten modernen Denkschule der Chirurgie beteiligt. Er hatte radikale Vorstellungen von der chirurgischen Ausbildung und plädierte für eine verlängerte chirurgische Lehre nach Abschluss des Medizinstudiums, die aus Vorarbeiten im Krankenhaus und anschließenden Operationen an Leichen und Versuchstieren bestehen sollte. Daran würde sich eine 2-3jährige Assistenzzeit in einer chirurgischen Abteilung anschließen, mit Studium der chirurgischen Literatur und dem Erwerb fortgeschrittener praktischer Fähigkeiten. Zu seinen Schülern gehörten Koryphäen wie Alexander von Winiwarter, Jan Mikulicz-Radecki und John B. Murphy. William Halsteds Pionierprogramm für chirurgische Assistenzärzte wurde stark von Billroths eigenen Methoden der chirurgischen Ausbildung beeinflusst.