Im Jahr 1993, als Santoro an der PUC-Rio Journalismus studierte, trat er in den Schauspieler-Workshop von Rede Globo ein. Santoro spielte anschließend in vielen Telenovelas von Rede Globo mit, wie Olho no Olho (1993), Pátria Minha (1994), Explode Coração (1995), O Amor Está no Ar (1997), Suave Veneno (1999) und Mulheres Apaixonadas (2003), sowie in der Miniserie Hilda Furacão (1998) in der Rolle eines Priesters. Santoro war auch der Synchronsprecher der Titelfigur in Stuart Little und dessen Fortsetzung in der brasilianischen Synchronfassung.
Seine erste größere Rolle in einer Kinoproduktion hatte er 2001 in Bicho de Sete Cabeças (Brainstorm) des brasilianischen Regisseurs Laís Bodansky. Am Ende des Films wurde er vom Publikum mit stehenden Ovationen gefeiert. Er gewann auch die Trophäe des Festivals für den besten Schauspieler. Nach Bicho hatte sich sein Ruf als Schauspieler gefestigt und er wurde für die männliche Hauptrolle in Abril Despedaçado (Behind the Sun) besetzt, einer der Nominierten für den besten ausländischen Film bei den Golden Globe Awards 2002. In dem Hector-Babenco-Film Carandiru (2003) spielte er Lady Di, eine transsexuelle Gefangene.
Der kanadische Regisseur Robert Allan Ackerman nahm Santoro für seine TV-Produktion The Roman Spring of Mrs. Stone unter Vertrag, nachdem er von seiner Leistung in Bicho de Sete Cabeças fasziniert war. Da Santoro keinen Agenten in Nordamerika hatte, nahm Ackerman Kontakt zu Santoros Vater auf. Er verbrachte zwei Monate mit Dreharbeiten in Rom, neben bekannten Schauspielern wie Helen Mirren und Anne Bancroft. Kurz nachdem er die Dreharbeiten zu Mrs. Stone beendet hatte, erhielt er ein Angebot von Columbia Pictures für eine Rolle in dem Blockbuster Charlie’s Angels: Full Throttle. Sein Auftritt in Charlie’s Angels brachte seine Karriere in Hollywood ins Rollen. Nach Charlie’s Angels spielte er die Rolle von Karl, dem rätselhaften Chefdesigner und Liebesinteresse von Laura Linneys Charakter, in der romantischen Komödie Love Actually, in der auch Colin Firth, Lucia Moniz, Hugh Grant, Emma Thompson, Keira Knightley und Rowan Atkinson zu sehen sind.
Er bekam auch Arbeit in der Werbebranche, als er 2002 in einer Werbekampagne mit Gisele Bündchen auftrat. Er spielte die männliche Hauptrolle in No. 5 The Film, dem 3-minütigen Werbespot für Chanel, bei dem Baz Luhrmann 2004 an der Seite von Nicole Kidman Regie führte.
Im Jahr 2006 stieß Santoro zur Besetzung von Lost als Überlebender des Oceanic-Flugs 815, Paulo. Sein erster Auftritt war in der Episode mit dem Titel „Further Instructions“. Sein Charakter wurde in der Episode „Exposé“ getötet. Er spricht seinen Charakter Paulo auch in der portugiesischen Synchronisation für Brasilien.
Santoro wurde 2006 als persischer Kaiser Xerxes in dem Film 300, basierend auf dem gleichnamigen Frank Miller Comic, besetzt. Die Rolle hatte viele spezielle Anforderungen, wie z.B. intensives Training für die Körperlichkeit der Rolle (Santoro hatte 24 Pfund abgenommen, um in einer brasilianischen Miniserie mitzuwirken), umfangreiche CG-Arbeiten, um den 1,80 m großen Santoro als den 1,80 m großen Gottkönig darzustellen, einen viereinhalbstündigen Make-up-Auftragsprozess und die vollständige Entfernung von Santoros Körperbehaarung zunächst durch Wachsen und dann durch Rasieren, als sich das als zu schmerzhaft erwies. Seine Augenbrauen blieben jedoch intakt, wurden mit Prothesen überdeckt und eingezeichnet, anstatt rasiert zu werden. Santoro las die Werke von Herodot, einem antiken griechischen Historiker, um sich auf seine Rolle vorzubereiten. Über Xerxes hat er gesagt:
Er ist reich, er ist arrogant, er ist ein sehr instabiler Größenwahnsinniger. Er will einfach die Welt erobern. Sein Ehrgeiz ist grenzenlos. Er will Ruhm, er will den Sieg, er will ewigen Ruhm. Unter all diesem Wollen ist er aber letztlich schwach und sehr unsicher.
Für seine Rolle in 300 wurde Santoro als erster brasilianischer Schauspieler bei den MTV Movie Awards in der Kategorie Bester Schurke nominiert. Er gewann jedoch nicht, und der Preis ging an Jack Nicholson für The Departed.
Er spielte den verstorbenen Fußballer Heleno de Freitas in dem Film Heleno aus dem Jahr 2012. Santoro spielte an der Seite von Arnold Schwarzenegger in dem Film The Last Stand von 2013 mit. Santoro spielte Garriga in dem Will-Smith-Drama-Film Focus (2015).
Santoro spielte 2016 Jesus in dem historischen Actionfilm Ben-Hur und erhielt für diese Rolle den persönlichen Segen von Papst Franziskus.