De 1853 a 1860 Billroth foi assistente na clínica cirúrgica de Bernhard von Langenbeck na Charité em Berlim. Lá também foi aprendiz de Carl Langenbuch. Em 1860, Billroth aceitou uma oferta da Universidade de Zurique para se tornar a Cátedra de Cirurgia Clínica, tornando-se director do hospital e clínica cirúrgica em Zurique. O início da sua carreira na Suíça foi pouco promissor: durante o seu primeiro semestre de ensino, teve apenas dez estudantes, e ele próprio disse que os rendimentos que recebia do seu consultório privado eram insuficientes para pagar a sua chávena de café da manhã. No entanto, a sua reputação cresceu rapidamente; Billroth tinha uma personalidade contagiante, atraindo tanto estudantes como estagiários de cirurgia para as suas fileiras. Era amado pelos seus estudantes, e era um professor universitário eficaz, bem como um professor graduado. Os estudantes juntaram-se às suas aulas, e com a cooperação de colegas enérgicos, ele foi capaz de elevar a Faculdade de Medicina de Zurique a uma posição de destaque entre as escolas de língua alemã em apenas alguns anos.
Enquanto que em Zurique, Billroth publicou o seu livro clássico Die allgemeine chirurgische Pathologie und Therapie (Patologia Cirúrgica Geral e Terapêutica) (1863). Ao mesmo tempo, introduziu o conceito de auditorias, publicando todos os resultados, bons e maus, o que resultou automaticamente numa discussão honesta sobre morbilidade, mortalidade e técnicas – com as consequentes melhorias na selecção de pacientes.
Foi nomeado professor de cirurgia na Universidade de Viena em 1867, em sucessão a Franz Schuh; aí, exerceu a cirurgia como chefe da Segunda Clínica Cirúrgica no Allgemeine Krankenhaus (Hospital Geral de Viena). Embora tenha lançado as bases da sua fama em Zurique, foi em Viena, um teatro maior e mais conspícuo, que se estabeleceu como o poder que tinha no mundo da cirurgia. Um discurso que proferiu em 1875, protestando contra a afluência de estudantes de medicina judeus, foi considerado como um dos primeiros eventos no desenvolvimento do anti-semitismo político vienense.
Durante a Guerra Franco-Prussiana, Billroth fez um excelente trabalho no hospital militar de Mannheim e Weissenburg, tratando uma variedade de ferimentos horríveis no campo de batalha com cirurgias agressivas e ambiciosas; encarnou a sua experiência de cirurgia de guerra nas suas Cartas Cirúrgicas de Mannheim e Weissenburg. Ficou tão impressionado com os horrores da guerra que foi sempre, posteriormente, um ardente defensor da paz. A 3 de Dezembro de 1891, proferiu um discurso sobre os cuidados com os feridos na guerra, o que causou uma profunda sensação e levou a que grandes somas de dinheiro fossem votadas pelas câmaras legislativas austríacas para a disponibilização de meios adequados de socorro aos feridos.
Não se limitou apenas à cirurgia, e realizou uma extensa pesquisa sobre uma doença que afectava muitos pacientes cirúrgicos na altura: a febre da ferida. O seu tratado sobre a febre da ferida, Untersuchungen über die Vegetationsformen von Coccobacteria septica (1874; “Investigations of the Vegetal Forms of Coccobacteria septica”) concluiu que a causa era bacteriana; Billroth foi rápido a utilizar técnicas anti-sépticas na sua prática cirúrgica, e o número de pacientes cirúrgicos afectados pela febre da ferida diminuiu muito. Com a ameaça de infecções cirúrgicas fatais diminuída através do seu trabalho e de outros”, Billroth passou a dedicar a sua atenção à cirurgia e ao campo pioneiro da alteração ou remoção de órgãos que anteriormente tinham sido considerados inacessíveis.
Uma das primeiras adopções da “bata branca” (como mostrado na c.1890 de Seligmann pintura), Billroth foi directamente responsável por uma série de marcos na cirurgia; em 1872, foi o primeiro a realizar uma esofagectomia, retirando uma secção do esófago e juntando as restantes partes. Em 1873, efectuou a primeira laringectomia, excisando completamente uma laringe cancerígena. Foi o primeiro cirurgião a excisar um cancro rectal e, em 1876, tinha realizado 33 operações deste tipo. Em 1881, Billroth tinha feito com que a cirurgia intestinal parecesse quase banal. Mas o seu feito mais famoso é inquestionavelmente a primeira gastrectomia bem sucedida para o cancro gástrico. A 29 de Janeiro de 1881, após muitas tentativas infelizes, Billroth realizou a primeira ressecção bem sucedida para o carcinoma antral em Therese Heller, que viveu durante quase 4 meses e morreu de metástases hepáticas. Ele realizou esta operação fechando o lado de maior curvatura do estômago e anatómico a menor curvatura do duodeno, numa operação ainda hoje conhecida como Billroth I.
A actividade literária de Billroth foi generalizada, com o número total de livros e artigos publicados, dos quais ele foi o autor, com cerca de cento e quarenta. Colaborou com Franz von Pitha num Manual de Cirurgia Geral e Especial (1882). Para tal, Billroth contribuiu com a secção sobre Escrofulose e Tuberculose, Lesões e Doenças da Mama, Instrumentos e Operações, Queimaduras, Frostbites, etc.
Billroth passou o seu espírito intelectual inquieto a numerosos estudantes distintos, criando a “Escola Billroth” de seguidores. Nenhum aspecto da sua profissão parecia escapar ao seu intenso escrutínio, seja investigação, ensino, administração, ou enfermagem. Ele não só tinha algo de valioso a dizer sobre cada um deles, como muitas vezes se certificou de que as suas ideias se tornassem realidade concreta. Em todas as esferas que procurou influenciar, foi guiado por uma crença na unidade da ciência e da arte, e pela confiança na sua própria capacidade de efectuar mudanças.
Billroth foi fundamental para estabelecer a primeira escola moderna de pensamento em cirurgia. Tinha ideias radicais sobre a formação cirúrgica, defendendo uma aprendizagem cirúrgica prolongada na conclusão de estudos médicos que consistia em trabalhos preliminares em hospitais, seguidos da realização de operações em cadáveres e animais experimentais. Seguir-se-ia um estágio de 2-3 anos num departamento cirúrgico com estudos da literatura cirúrgica e a aquisição de competências práticas avançadas. Entre os seus discípulos encontravam-se luminárias como Alexander von Winiwarter, Jan Mikulicz-Radecki e John B. Murphy. O programa de residência cirúrgica pioneiro de William Halsted foi grandemente influenciado pelos próprios métodos de educação cirúrgica de Billroth.