Pacientes ingerem ureia rotulada com um isótopo incomum, seja carbono-14 radioactivo ou carbono-13 não radioactivo. Nos 10-30 minutos subsequentes, a detecção de dióxido de carbono marcado com isótopos no hálito exalado indica que a ureia foi dividida; isto indica que a urease (a enzima que H. pylori usa para metabolizar a ureia) está presente no estômago, e portanto que as bactérias H. pylori estão presentes.
Para as duas formas diferentes de ureia, é necessária uma instrumentação diferente. O carbono-14 é normalmente medido por cintilação, enquanto que o carbono-13 pode ser detectado por espectrometria de massa de razão isotópica ou por espectrometria de correlação de massa. Para cada um destes métodos, é necessária uma amostra de sopro de base antes de tomar a ureia marcada com isótopos, para comparação com a amostra pósureia, com uma duração de 20 a 30 minutos entre eles. As amostras podem ser enviadas para um laboratório de referência para análise. Alternativamente, a espectrometria de correlação de massa pode ser executada como um teste baseado em escritório, uma vez que as amostras de respiração são continuamente recolhidas, e os resultados são fornecidos imediatamente em minutos.
A diferença entre as medições pré e pós ureia é utilizada para determinar a infecção. Este valor é comparado com um valor de corte. Assume-se que os resultados abaixo do valor são negativos, os acima são positivos. O próprio valor de corte é determinado comparando os resultados dos pacientes com dois ou mais métodos de detecção diferentes. O valor escolhido é o que dá a melhor combinação de sensibilidade e especificidade. Tanto o teste do carbono-14 como o teste do hálito de ureia carbono-13 têm elevada sensibilidade e especificidade, embora o teste carbono-13 seja preferido em certas populações devido à sua natureza não radioactiva.
O teste mede a infecção activa por H. pylori. Se os antibióticos estiverem a deprimir a quantidade de H. pylori presente, ou se as condições estomacais forem menos ácidas do que o normal, a quantidade de urease presente será reduzida.
De acordo, o teste só deve ser realizado 14 dias após a paragem da medicação redutora de ácido (inibidores da bomba de protões, PPI) ou 28 dias após a paragem do tratamento antibiótico. Alguns clínicos acreditam que um reservatório de H. pylori em placa dentária pode afectar o resultado.