Em 1993, enquanto Santoro estudava Jornalismo na PUC-Rio, entrou na Oficina do Actor da Rede Globo. Santoro passou a desempenhar papéis em muitas das telenovelas da Globo, tais como Olho no Olho (1993), Pátria Minha (1994), Explode Coração (1995), O Amor Está no Ar (1997), Suave Veneno (1999) e Mulheres Apaixonadas (2003), bem como na minissérie Hilda Furacão (1998), no papel de padre. Santoro foi também o actor de voz da personagem titular em Stuart Little e a sua sequela nas cópias dubladas brasileiras.
O seu primeiro grande papel numa produção cinematográfica veio em 2001, com Bicho de Sete Cabeças (Brainstorm) do realizador brasileiro Laís Bodansky. No final do filme, recebeu uma ovação de pé do público. Ganhou também o troféu de melhor actor do festival. Depois de Bicho, a sua reputação como actor tinha sido solidificada e ele foi elenco como líder masculino em Abril Despedaçado (Abril Despedaçado), um dos nomeados para melhor filme estrangeiro nos Prémios Globo de Ouro 2002. No filme Carandiru de Hector Babenco 2003 interpretou Lady Di, uma prisioneira transexual.
O realizador canadiano Robert Allan Ackerman assinou Santoro para a sua produção televisiva The Roman Spring of Mrs. Stone depois de ter sido hipnotizado pela sua actuação em Bicho de Sete Cabeças. Como Santoro não tinha um agente na América do Norte, Ackerman contactou o pai de Santoro. Passou dois meses a filmar em Roma, ao lado de actores de renome como Helen Mirren e Anne Bancroft. Pouco depois de terminar as filmagens para a Sra. Stone, recebeu uma oferta da Columbia Pictures para um papel no blockbuster Charlie’s Angels: Anjos de Charlie. A sua actuação em Charlie’s Angels deu o pontapé de saída para a sua carreira em Hollywood. Depois de Charlie’s Angels, interpretou a personagem de Karl, o enigmático designer-chefe e o interesse amoroso da personagem de Laura Linney, na comédia romântica Love Actually, que também apresenta Colin Firth, Lucia Moniz, Hugh Grant, Emma Thompson, Keira Knightley, e Rowan Atkinson.
Começou também a trabalhar no ramo da publicidade ao aparecer numa campanha comercial com Gisele Bündchen em 2002. Desempenhou o papel principal masculino no filme nº 5 The Film, o comercial de 3 minutos para Chanel, realizado por Baz Luhrmann ao lado de Nicole Kidman em 2004.
Em 2006, Santoro juntou-se ao elenco de Lost como sobrevivente do Oceanic Flight 815, Paulo. A sua primeira aparição foi no episódio intitulado, “Instruções Adicionais”. O seu personagem foi morto no episódio “Exposé”. Ele também exprime o seu personagem Paulo no dub português para o Brasil.
Santoro foi elenco como Imperador Persa Xerxes no filme 300, baseado na banda desenhada Frank Miller com o mesmo nome, em 2006. O papel tinha muitos requisitos especiais, tais como treino intensivo para a fisicalidade do papel (Santoro tinha perdido 24 libras para trabalhar numa minissérie brasileira), trabalho extensivo de CG para retratar o Santoro de 6’2″ como o God-King de 7 pés, um processo de aplicação de maquilhagem de quatro horas e meia e a remoção completa dos pêlos do corpo de Santoro primeiro pela depilação com cera e depois pela depilação quando isso se revelou demasiado doloroso. No entanto, as suas sobrancelhas foram mantidas intactas, cobertas com próteses e atraídas em vez de serem depiladas. Santoro leu as obras de Heródoto, um historiador grego antigo, a fim de se preparar para a sua parte. Em relação a Xerxes, ele declarou:
É rico, é arrogante, é um megalómano muito instável. Ele só quer conquistar o mundo. A sua ambição é ilimitada. Ele quer glória; ele quer vitória; ele quer fama eterna. No entanto, por baixo de tudo o que quer, ele é em última análise fraco e muito inseguro.
p>Para o seu papel em 300, Santoro tornou-se o primeiro actor brasileiro nomeado para os MTV Movie Awards na categoria de Melhor Vilão. No entanto, não ganhou, e o prémio foi para Jack Nicholson por The Departed.
Ele interpretou o falecido jogador de futebol Heleno de Freitas no filme Heleno de 2012. Santoro co-estrelou ao lado de Arnold Schwarzenegger no filme The Last Stand, de 2013. Santoro interpretou Garriga no filme dramático Will Smith Focus (2015).
Santoro interpretou Jesus no filme histórico de acção Ben-Hur de 2016 e recebeu bênçãos pessoais do Papa Francisco por este papel.