Fonte de amostra humana
Um total de 133 embriões humanos em fase 2PN utilizados no estudo actual foram obtidos do RENEW Biobank da Universidade de Stanford, com o consentimento informado por escrito de que foram doados para investigação não-temporal. Todos os embriões foram congelados na fase zigótica ou 2PN, e é muito provável que estes embriões representem a população típica da FIV, uma vez que não foram seleccionados antes da criopreservação. A desidentificação foi realizada em conformidade com o protocolo “The RENEW Biobank”, que foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Stanford. Nenhuma informação sanitária protegida foi associada com os embriões. Dos 133 embriões descongelados, 91 apareceram vivos após o descongelamento, e os restantes foram excluídos por não serem visivelmente viáveis (antes de qualquer aspiração de micropipetas). Mais dois embriões foram excluídos dos nossos dados porque estavam estruturalmente danificados durante a aspiração de micropipetas e devido à ruptura de ZP, deixando-nos com 89 embriões humanos totais no nosso conjunto de dados. Estes 89 embriões humanos foram descongelados e medidos em grupos menores ao longo de seis experiências separadas.
Cultura de embriões humanos
Embriões humanos foram descongelados usando um Quinn’s Advantage Thaw Kit (CooperSurgical) como descrito anteriormente26,27. Em resumo, crioviais ou palhinhas foram removidos do tanque de azoto líquido e expostos ao ar antes de serem colocados num banho de água a 37°C. Uma vez descongelados, os embriões foram incubados em meio de descongelamento de 0,5 e 0,2 M de sacarose a 37 °C durante 10 min cada. Os embriões foram então lavados em solução diluente de descongelamento a 37 °C e cultivados durante 3-4 h no meio de clivagem de vantagem de Quinn (CooperSurgical) suplementado com 10% de substituto proteico de soro (CooperSurgical). Em algumas experiências, embriões foram monitorizados para o seu desenvolvimento utilizando o Sistema Eeva (Auxogyn).
Recolha de embriões e oócitos de rato e IVF
Estirpe híbrida (C57B6xDBA2) Ratos F1 (fêmeas de 4-6 semanas) foram adquiridos no Laboratório Jackson e mantidos nas instalações para animais no edifício de investigação de células estaminais de Lorry Lokey. Todas as experiências foram realizadas ao abrigo do protocolo #16146 do Comité de Cuidados e Utilização de Animais Institucionais, que foi aprovado pelo Painel Administrativo de Cuidados de Animais de Laboratório da Universidade de Stanford. Em resumo, os ratos fêmeas foram superovulados por injecção intraperitoneal de 10IU de gonadotrofina sérica de égua grávida (PMSG, Sigma) 10IU de gonadotrofina coriónica humana (hCG, Sigma). Após o acasalamento de uma fêmea com um macho de 8-10 semanas da mesma estirpe, os complexos cúmulos-oócitos foram recolhidos de ovidutos em meios M2 (Millipore) e as células cúmulos foram removidas em hialuronidase (Sigma) e lavadas em meios M2. Após medições mecânicas, os embriões foram cultivados em meio de clivagem de vantagem de Quinn (CooperSurgical) com 10% de substituto proteico sérico (CooperSurgical). Para medir o efeito da maturação dos oócitos na mecânica, os oócitos foram colhidos em várias fases de maturação. Os oócitos GV foram colhidos 48 h após a injecção de PMSG. Aproximadamente 48 h após a injecção de PMSG, o hCG foi injectado. Os oócitos MI foram recolhidos 5-6 h após a injecção de hCG, e os oócitos MII foram recolhidos 18-20 h após a injecção de hCG.
Embriões foram excluídos dos nossos dados se mostrassem uma morfologia muito pobre, se viessem de ratos que produzissem menos de 10 embriões ou se estivessem num grupo onde menos de 40% dos embriões mostrassem formação de pronúcleos após FIV. Se os ratos produziram muito poucos embriões ou as taxas de fertilização foram demasiado baixas, considerámos que algumas partes do protocolo experimental (injecção hormonal, meios de comunicação, etc.) devem ter afectado negativamente os embriões e, portanto, podem não ser representativos de embriões normais de ratos. Para classificar os embriões em grupos de controlo e medição, estes foram separados aleatoriamente enquanto eram vistos sob uma ampliação suficientemente baixa que a morfologia era difícil de distinguir. Apenas alguns embriões foram mantidos como controlos negativos em cada experiência, somando um total de 35 em todas as experiências (Fig. 5 suplementar). Os tamanhos das amostras para experiências com animais foram determinados em parte pela quantidade de dados necessários para atingir significância estatística, e em parte pelo tamanho das amostras vistas em publicações com investigação semelhante. Dados mecânicos e de formação de blastocistos para os 282 embriões de rato que medimos (Suplementar Fig. 4 e Suplementar Fig. 5) foram recolhidos ao longo de 15 experiências separadas.
Microinjecção de oócitos de rato e IVF
Uma estirpe de rato CBA do Laboratório Jackson foi utilizada nesta experiência. Após a superovulação induzida de ratos fêmeas de 4-6 semanas, foram recolhidos os oócitos de metafase II e removidas as células cúmulos. Os oócitos foram então microinjectados com ∼10 pl de anticorpo monoclonal 18A10 (abCam) a uma concentração de 1 mg ml-1. Alguns oócitos foram mantidos como controlos negativos e foram submetidos a injecção falsa com água ou sem qualquer injecção. Os oócitos foram então cultivados durante uma hora antes da FIV convencional. Os esperma foram colhidos de 8-10 semanas de CBA machos (Laboratório Jackson) e deixados a capacitar em meios HTF (CooperSurgical) durante 45 min antes da inseminação. Uma quantidade apropriada da suspensão de esperma foi adicionada à gota de meios onde os oócitos foram cultivados. Nenhuma amostra foi excluída desta experiência, e os oócitos foram classificados em grupos de controlo versus grupos medidos sem ter em conta a morfologia e numa ordem aleatória.
Medição das propriedades mecânicas do embrião
Um sistema automatizado de aspiração de micropipetas foi utilizado para medir os embriões, e um microscópio de luz personalizado foi utilizado para gravar o vídeo da aspiração. O microscópio de luz foi construído com peças de Thorlabs, e utiliza uma objectiva olímpica de abertura numérica × 20, 0,4 e iluminação por díodos emissores de luz branca. Para realizar uma medição, cada embrião é colocado na sua própria gota de material e a micropipeta é baixada para a gota. O embrião é manipulado com a pipeta para que o corpo polar esteja virado para longe da abertura da pipeta. A falta de controlo para a posição de medição pode confundir os nossos resultados, uma vez que existe um espaço entre o oolemma e ZP próximo do corpo polar, enquanto que este espaço perivitelino é muito menor em torno do resto do embrião. Estudos também demonstraram que a tensão cortical dos oócitos é polarizada em relação ao fuso meiótico66; por conseguinte, tivemos o cuidado de medir a extremidade do embrião oposto ao corpo polar, que está normalmente perto do fuso.
Micropipetas para medir embriões de rato tinham 40-μm de diâmetro interior (Origio MBB-FP-L-15); as de embriões humanos tinham 70-μ de diâmetro interior e foram feitas à medida pelo Origio. Uma pressão de retenção de -0,03 p.s.i. é aplicada para segurar o embrião e selar a abertura da pipeta. Em seguida, é aplicada uma pressão de passo de -0,345 p.s.i. ao embrião. A pressão desejada é aplicada utilizando um sistema de controlo PID de ciclo fechado. Um actuador linear (Firgelli L12) move a rolha de uma seringa de 1 ml, e um sensor (Honeywell SSCSNBN010NDAA5) mede a pressão. Estes são ligados a um computador através de um microcontrolador Arduino Uno que pode retransmitir leituras de sensores e dar comandos ao actuador em tempo real. Um vídeo da aspiração é gravado a 75 f.p.s. usando uma câmara CMOS (Thorlabs DCC1545M). Todo o hardware é controlado utilizando o software Labview feito à medida (National Instruments). Foi utilizado um programa Matlab automatizado feito à medida (Mathworks) para extrair a profundidade de aspiração do embrião e adaptá-lo a um modelo mecânico. Detecção de arestas canny e limiar foram utilizados para identificar o canto e abertura da pipeta. A correspondência de modelos com base em correlação cruzada foi utilizada para seguir automaticamente a borda do embrião ao longo do tempo, a fim de remover o viés das medições manuais. Durante a medição dos parâmetros mecânicos do embrião, o investigador foi cego ao facto de terem ou não sobrevivido à fase de blastocisto, ou a que grupo pertenciam (no caso das experiências de microinjecção).
Modelo mecânico de embriões de uma célula
Um modelo sólido linear elástico modificado (modelo Zener modificado) foi utilizado para representar o embrião tal como foi aspirado para a micropipeta. Assumindo uma entrada de passo para a força aplicada ao embrião, a equação para a profundidade de aspiração ao longo do tempo é:
onde
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O modelo Zener modificado foi escolhido em vez de outros modelos viscoelásticos comummente utilizados, tais como o Maxwell, Kelvin-Voigt e Zener (Sólido Linear Padrão) com base na inspecção visual da dinâmica de resposta. Observámos nas nossas experiências que a resposta de um embrião a um passo de pressão de entrada era um alongamento instantâneo seguido de um componente de decaimento exponencial (invertido de modo que a deformação aumentava com o tempo), finalmente seguido de uma deformação a um ritmo constante como mostrado na Fig. 2c.
Um corpo Maxwell consiste de uma mola e de um ponto de fuga em série; portanto, a sua resposta a um passo de pressão é um alongamento instantâneo seguido de uma deformação linear estável. Como os nossos dados apresentavam uma clara componente exponencial, este modelo foi considerado insuficiente para descrever o nosso sistema. Um corpo Kelvin-Voigt consiste de uma mola e um tablier em paralelo; portanto, a sua resposta a uma pressão por degrau é um exponencial em decadência, onde a profundidade de aspiração se fixa numa profundidade máxima final. Este modelo não capta o alongamento instantâneo experimentado pelo embrião, bem como a taxa linear de deformação após o componente exponencial se assentar. O modelo Zener adiciona uma mola extra em paralelo ao corpo Maxwell e a sua resposta à pressão é semelhante à de um corpo Kelvin-Voigt, mas com um alongamento instantâneo quando a pressão é aplicada pela primeira vez. Ainda assim, este modelo exigiu a adição de um traço extra em série com os outros três componentes para capturar com precisão a deformação linear experimentada pelo embrião após o componente exponencial estabelecido.
Uma comparação do erro de ajuste para cinco modelos diferentes é mostrada na Fig. 10 suplementar. O nosso modelo (que tem 4 parâmetros) parece apropriado porque o seu erro é quase tão baixo como o erro do modelo de cinco parâmetros, com ou sem o parâmetro extra desnecessário. Por conseguinte, acreditamos que o nosso modelo descreve com precisão os dados sem sobreajustar.
Avaliação da viabilidade embrionária e parâmetros do ciclo celular
Formação de vasostocisto foi utilizada como um proxy de viabilidade ao construir um classificador para distinguir entre embriões viáveis e não viáveis com base na mecânica. Este classificador foi validado em rato, tal como demonstrado pelas experiências com nascidos vivos na Fig. 2. Após a medição dos parâmetros mecânicos do embrião no dia 1, os embriões foram cultivados durante 5-6 dias dentro do sistema Auxogyn Eeva, com quadros capturados a cada 5 min. Os parâmetros do ciclo celular27 foram extraídos dos vídeos resultantes, e os embriões que formavam blastocistos por dia 5 (rato) ou dia 6 (humano) foram categorizados como viáveis.
Previsão da viabilidade do embrião
A sobrevivência do blastocisto foi utilizada como informação da verdade do solo para treinar um classificador para prever a viabilidade do embrião com base nas medições mecânicas do dia 1. Um classificador SVM binário com um núcleo RBF foi treinado em parâmetros mecânicos embrionários. Os valores óptimos para a restrição da caixa (c) e sigma RBF (σ) foram escolhidos usando uma validação cruzada de 10 vezes. Uma vez determinados os parâmetros óptimos de SVM, foram realizadas 100 simulações Monte Carlo de validação cruzada de 10 vezes para calcular a área média sob a curva ROC e a curva PR.
Porque um total de quatro parâmetros mecânicos foram medidos para cada embrião, foi feita uma selecção de características para a frente para determinar o número óptimo de parâmetros a incluir no nosso classificador de viabilidade. Os resultados deste processo são apresentados na Fig. 2C suplementar, demonstrando que há uma grande melhoria ao utilizar dois parâmetros em vez de um, e uma ligeira melhoria ao adicionar um terceiro parâmetro. A utilização dos quatro parâmetros reduz a eficácia do nosso classificador porque o quarto parâmetro não é útil na separação de embriões por viabilidade, mas acrescenta uma dimensão extra aos dados.
Para efectuar a selecção de características de avanço, primeiro cada parâmetro foi utilizado por si só para separar embriões e foi encontrado um classificador óptimo. Como descrito acima, foi realizada uma validação cruzada de 10 vezes para estimar a área sob a curva ROC para esse parâmetro. Uma vez escolhido o parâmetro com o maior valor preditivo, um novo classificador foi treinado e optimizado utilizando cada um dos restantes parâmetros. O parâmetro que causou a maior melhoria no valor preditivo foi adicionado ao classificador, e o processo foi repetido até não haver mais parâmetros.
Para as experiências de libertação de grânulos corticais, os números foram mostrados utilizando apenas o parâmetro mais preditivo de viabilidade (rigidez, k1) para simplificar. O classificador de três parâmetros previamente treinado foi utilizado para classificar os embriões por viabilidade, mas determinámos os números para serem mais claros quando se utilizasse apenas a rigidez.
Experiências de nascimento vivo do rato
CD1 ratos fêmeas foram comprados ao Laboratório Jackson e acasalados com machos vasectomizados para servirem de receptores pseudo-grávidas. Os ratos foram mantidos nas mesmas condições que os utilizados para a colheita de embriões. Os parâmetros mecânicos dos embriões colhidos de (C57B6xDBA2) ratos F1 foram medidos e os embriões foram classificados em grupos viáveis ou não viáveis com base nestes parâmetros. Em cada experiência, um número igual de embriões de ratos de uma célula (entre 10 e 15) foram transferidos para o oviduto de um receptor de embriões recentemente entupido. Esta experiência foi repetida quatro vezes (Quadro Complementar 1) com 10-15 embriões transferidos para cada rato em cada experiência. O técnico que transferiu os embriões foi cego para quais embriões estavam em que grupo. O mesmo número de embriões na mesma fase de desenvolvimento foi escolhido aleatoriamente e transferido para ratos pseudográvidos como controlo. Os cachorros eram esperados no dia 20 após a cirurgia. Foi realizado um teste χ2 para testar se a diferença no número de cachorros nascidos em cada grupo (viáveis, não viáveis ou controlo) era estatisticamente significativa.
RNA-seq preparação da amostra
Duas experiências separadas foram realizadas com um total de 32 embriões humanos 2PN para obter amostras para RNA-seq. Os embriões foram autorizados a recuperar durante 3-4 h em meios de cultivo após descongelação e os parâmetros mecânicos foram medidos. Cada embrião foi classificado como viável ou não viável com base nos seus parâmetros mecânicos. cDNA de cada embrião foi sintetizado a partir do RNA total usando o kit SMARTer Ultra Low RNA (Clontech) de acordo com o protocolo do fornecedor. Após a tosquia Covaris de cDNA total, foram geradas bibliotecas finais utilizando o NEBNext DNA Sample Prep Master Mix Set (New England Biolabs) e submetidas a controlo de qualidade com um bioanalisador Agilent 2100. As amostras resultantes foram então submetidas para RNA-seq monocelular numa plataforma Illumina HiSeq 2000 utilizando a estratégia de sequenciação de 100-bp paired-end.
Sair de 25 embriões escolhidos para sequenciação, três embriões foram excluídos devido a dificuldades técnicas (nenhum RNA recuperado). Submetemos um total de 22 embriões para sequenciação, que foram classificados como viáveis ou não viáveis com base em parâmetros mecânicos.
RNA-seq processamento de dados
Sequenciação devolvida ∼1 biliões de leituras de ponta de paired-end de comprimento 101 pertencentes a 22 embriões no total. Os dados de sequência bruta em formato fastq foram passados através de controlo de qualidade para remover chamadas de base de baixa qualidade e sequências de adaptador (aparador e clipper FastX). As sequências filtradas foram então alinhadas ao genoma humano de referência (hg18) com a ferramenta de alinhamento STAR67 num computador. Os ficheiros .bam resultantes foram filtrados para qualidade de alinhamento, classificados e as duplicações PCR retiradas (SAMtools sort e rmdup). As contagens por gene foram então calculadas utilizando HTSeq-count68 e comparando as leituras alinhadas com a transcrição humana de referência.
Para contabilizar os possíveis efeitos de lote decorrentes da variação biológica entre pacientes, diferentes protocolos de congelamento, meios de cultura ou outros factores, tivemos de determinar que embriões provinham de que pacientes. Analisámos variantes de sequência nas transcriptomas de cada embrião, e realizámos agrupamento hierárquico nas variantes para as quais tivemos uma boa cobertura de sequenciação (Suplemento Fig. 11). Determinámos que dos 22 embriões sequenciados, 17 tinham embriões ‘irmãos’, enquanto 5 eram os únicos embriões dos seus respectivos pacientes. Excluímos esses cinco, e depois utilizámos a função ComBat no pacote de sva69,70 em R para remover efeitos de lote dos dados do RNA-seq dos restantes 17 embriões. Embora a exclusão dos cinco embriões sem irmãos possa ter distorcido os nossos resultados, teria sido impossível estimar a variação biológica dentro desses pacientes utilizando apenas uma amostra e, por conseguinte, tivemos de os excluir. Após a remoção destes efeitos de lote, os nossos dados reflectiram diferenças nas transcrições herdadas maternalmente entre embriões viáveis e não viáveis, consistentes entre todas as pacientes. A análise da expressão diferencial foi conduzida nos dados ajustados utilizando o R edgeR28 da embalagem. Os genes com valores q (valores P ajustados pelo método Benjamini-Hochberg) inferiores a 0,01 foram classificados como estatisticamente significativos.
Gene ontologia e análise de rede
A lista de genes DE com valores q<0,01 foi passada para a ferramenta DAVID (NCBI), e o agrupamento foi realizado com termos ontológicos relacionados com PBs e funções moleculares (MFs). Clusters com pelo menos um termo com um valor P ajustado<0,05 foram considerados estatisticamente significativos e incluídos no Quadro 1. Os termos dentro de cada agrupamento foram combinados numa única frase descritiva e incluídos no Quadro 1. Foram realizadas mais análises ontológicas de genes com os pacotes goseq e GO.db em R. Todas as categorias ontológicas de genes com pelo menos 10 genes foram classificadas por ordem da percentagem de genes DE dentro dessa categoria, e comparadas com a proporção de genes DE em todas as categorias.
p>IPA foi utilizada para analisar a lista de genes DE juntamente com a alteração logarítmica entre embriões viáveis e não viáveis. Foi realizada uma análise central para encontrar processos celulares que se previa que fossem significativamente aumentados ou diminuídos com base nas alterações de expressão genética, bem como redes de genes que foram regulados como um grupo.
Cortical granule staining
Os parâmetros mecânicos dos embriões de ratos B6 e embriões de FIV (de ratos CBA) foram medidos na fase de zigoto em duas experiências separadas. Os embriões foram classificados como viáveis ou não viáveis com base nos seus parâmetros mecânicos, e depois a ZP foi removida expondo brevemente os embriões à solução de Tyrode (Sigma), seguida de três lavagens em PBS (Invitrogen). Os embriões desnudados foram então fixados em paraformaldeído a 4% durante 20 min à temperatura ambiente e corados com anticorpo Lectina marcada com isotiocianato fluorescente (Sigma) e 4,6-diamidino-2-fenilindole. Um microscópio confocal de varrimento a laser Zeiss LSM510 foi utilizado para visualização e captura de imagem.
Processamento de imagem focal
P>Pilhadas de imagens em bruto foram convertidas para o formato TIFF e foram escritos scripts Matlab personalizados para extrair parâmetros de imagem. Foi efectuado um ajuste de contraste em todas as imagens de cada pilha para contabilizar a perda de sinal em maiores profundidades de imagem, e foi calculada uma imagem de projecção para cada pilha. O citoplasma de cada célula foi isolado através da realização de um limiar automático utilizando o método de Otsu, a detecção de arestas Canny e uma transformação circular Hough para detectar a localização e o tamanho de cada célula. Foi calculado um perfil de intensidade ao longo de um caminho em torno da circunferência de cada célula, a 95% do raio da célula, e com uma largura de 10% do raio da célula. Os parâmetros traçados na imagem 4 foram (a) a média e (b) s.d. deste perfil de intensidade. O investigador foi cego aos parâmetros mecânicos e grupo de cada embrião (no caso das experiências de microinjecção) enquanto media os parâmetros do grânulo cortical.
Testes estatísticos
A χ2-teste foi utilizado para testar se a proporção de embriões que resultaram em nascimento vivo (secção 2.2) era significativamente diferente entre os três grupos experimentais (previsto viável com base na mecânica, previsto não viável com base na mecânica e controlo-seleccionado apenas pela morfologia). A única suposição feita por este teste é que nenhum grupo (um “grupo” refere-se a embriões que resultem em nascimento vivo, ou embriões que não resultem em nascimento vivo) contém menos de cinco amostras. Esta suposição é cumprida para ambas as comparações que foram realizadas (viável versus controlo, viável versus não viável).
Para determinar genes com diferenças significativas na expressão entre embriões humanos viáveis e não viáveis, foram utilizados os pacotes de sva e edgeR em R. Estas embalagens foram bem validadas para utilização na remoção de efeitos de lote e na determinação de diferenças significativas na expressão dos dados de RNA-seq.
Foi utilizado um teste Wilcoxon rank sum para comparar o brilho do grânulo cortical entre embriões (não foi utilizado um teste t porque as amostras tinham números baixos e não eram normalmente distribuídas de acordo com o teste Lilliefors). Para determinar se a injecção do anticorpo IP3 alterou a rigidez média do embrião, foi utilizado um teste t de duas faces porque os grupos anticorpos injetados e controlados foram determinados para serem distribuídos normalmente utilizando o teste de Lilliefors. Foi utilizado um teste de Kolmogorov-Smirnov de duas amostras para mostrar que a injecção do anticorpo causou uma alteração significativa na distribuição dos valores de rigidez. Os testes de Wilcoxon rank sum foram utilizados para comparar as diferenças entre quartis dos grupos anti-corpo injectado e controlado, porque havia muito poucas amostras em cada quartil. Os testes de Wilcoxon rank sum foram também utilizados para testar a diferença nos valores medianos da rigidez dos oócitos entre os estágios GV, MI e MII porque os valores de rigidez não cumpriam os critérios de normalidade.