Todos ouvimos falar de centrifugação, ou mais especificamente, das histórias de horror associadas à centrifugação que correu mal, como no caso do famoso acidente de centrifugação Cornell. A maioria dos erros relacionados com a centrifugação deve-se ao mau manuseamento por parte do utilizador. Por conseguinte, é crucial compreender por que razão fazemos o que fazemos durante a centrifugação para evitar danificar a máquina e o pessoal. Aqui, enumerei algumas das questões mais comuns que podem ser facilmente ignoradas durante a centrifugação e porque são tão importantes para o manuseamento adequado de uma centrifugação.
É Tudo Sobre o Equilíbrio
A centrifugação produz forças centrífugas para separar eficazmente os componentes da amostra com base no tamanho e densidade. Pequenos desequilíbrios de peso podem causar vibrações anormais que podem danificar o rotor. Uma centrifugação desequilibrada é tão perigosa como uma reacção química instável. Pode não só danificar o instrumento mas também provocar um efeito dominó de catástrofes desde a falha do instrumento, até à quebra da amostra que pode libertar contaminantes potencialmente nocivos para o ambiente (amostras infecciosas, aerossóis nocivos, etc.).), e lesões do utilizador, em geral, resultando na destruição em grande escala e representando um grande perigo para a segurança.
A) A Necessidade de Equilíbrio Preciso a Altas Velocidades
O equilíbrio preciso é crucial durante as centrifugações de alta velocidade. Para compreender melhor isto, precisamos de voltar a alguns conceitos básicos de física. De acordo com a segunda lei de Newton, força (F) é igual a massa (M) vezes aceleração (A). Assim, a força centrífuga gerada durante a centrifugação é directamente proporcional à massa da amostra e à aceleração. Durante o movimento circular, a aceleração está relacionada com a velocidade de rotação e o raio do rotor. A velocidades elevadas, mesmo pequenas variações na massa da amostra podem levar a um desequilíbrio de força substancial, que pode ser catastrófico.
B) Equilíbrio baseado no tipo de rotor
Independentemente de a centrífuga ter um rotor de ângulo fixo ou um rotor de balão, dois factores importantes a considerar ao equilibrar incluem o volume da amostra e a disposição simétrica dos tubos. É importante assegurar que os volumes de amostra são iguais em todos os tubos e que os tubos são colocados directamente uns contra os outros na centrífuga. Se houver um número desigual de tubos, uniformizar adicionando um tubo extra cheio de água ao mesmo volume que os tubos experimentais. Se as soluções não forem de densidade semelhante (por exemplo, acetona e água), os tubos devem ter a mesma massa e não o mesmo volume para serem correctamente equilibrados. Um factor adicional a considerar no caso de rotores de balão é certificar-se de que todas as ranhuras contêm baldes de rotor apropriados para a máquina e com o mesmo peso.
2. RCF vs. RPM e Why It Matters
RCF (força centrífuga relativa ou força g) e RPM (rotações por minuto) são comumente usadas para descrever a velocidade centrífuga. No entanto, estas unidades são completamente diferentes. RPM denota a velocidade de rotação, que depende do raio do rotor. RCF denota a força centrífuga sobre as amostras e tem em conta tanto o raio do rotor como a velocidade de rotação. A mesma RCF pode ser obtida em centrífugas com diferentes tamanhos de rotor, ajustando adequadamente a RPM. Isto faz com que a RCF seja a unidade de passagem para descrever as velocidades centrífugas, uma vez que pode ser comparada entre centrífugas, enquanto que a RPM só é constante para centrífugas com o mesmo raio de rotor. Simplificando, RPM não é igual a RCF, e as definições de velocidade RPM precisam de ser convertidas em RCF para assegurar que a força centrífuga correcta é aplicada.
3. Tempo, Velocidade, e Centrifugação
A escolha da velocidade de centrifugação depende do tamanho e fragilidade das partículas na amostra. Quanto menor o tamanho da partícula, maior a velocidade de centrifugação. Por exemplo, as células bacterianas são granuladas a velocidades mais elevadas (2000-10.000 x g) do que as células de mamíferos (500-2000 x g). Além disso, velocidades de centrifugação mais baixas podem ser utilizadas com amostras mais frágeis.
Outro factor crítico que influencia a eficiência da separação é a RCF. O RCF é proporcional ao raio do rotor e ao quadrado de RPM. Devido a esta dependência quadrada da RCF em RPM, velocidades de centrifugação de 1000 RPM durante 5 minutos e 500 RPM durante 10 minutos não são intercambiáveis. A primeira produz uma RCF muito maior do que a segunda. Assim, é importante considerar a RCF ao determinar a velocidade e tempo para a sua centrifugação.
4. Centrifugação a Diferentes Temperaturas
Centrifugação gera calor, que pode aumentar a temperatura dentro de uma centrifugação (por vezes, em mais de 15°C). Isto pode afectar a estabilidade das amostras sensíveis à temperatura. Nesses casos, as centrífugas refrigeradas são geralmente preferidas. Contudo, temperaturas constantes também podem ser mantidas numa centrífuga ambiente. A temperatura da amostra durante a centrifugação é principalmente influenciada por três factores: material do rotor, forma do rotor, e velocidade de rotação.
A) Material do rotor
Durante a centrifugação, a temperatura pode ser influenciada pela condutividade térmica do material do rotor. Rotores feitos de metal, tais como aço e alumínio, têm uma alta densidade e alta condutividade térmica. Eles transferem calor eficientemente e arrefecem rapidamente. Pelo contrário, materiais como polímeros e fibras de carbono são isolantes térmicos e mantêm uma temperatura constante.
B) Forma do rotor
A forma do rotor determina o fluxo de ar dentro de uma centrífuga, semelhante à forma como as pás de um ventilador eléctrico influenciam o fluxo de ar para dentro e para fora da máquina. A optimização do fluxo de ar dentro de uma centrífuga através da forma do rotor é essencial para manter a temperatura.
C) Speed
A velocidade de rotação é directamente proporcional ao aumento da temperatura – a velocidades mais elevadas, é gerado mais calor. É importante compreender a velocidade máxima da centrífuga e a gama de velocidades que mantém uma gama de temperaturas que não alterará o resultado da experiência. Normalmente, esta informação será fornecida pelo fabricante no manual do equipamento para ajudar o utilizador a compreender as limitações e a trabalhar à sua volta.
5. Para travar ou não travar
Durante a centrifugação, a separação dos componentes da amostra continua durante a fase de desaceleração. Muitas centrifugadoras oferecem a opção de controlar as definições de desaceleração (travagem) para a parar mais rapidamente, mas quando é que precisamos realmente desta opção, e qual é o efeito nos resultados das amostras?
A travagem pode ser particularmente útil durante as centrifugações que envolvem extracções de ácido nucleico ou peletização de células bacterianas, que não são afectadas pela paragem súbita. Contudo, para experiências que são mais sensíveis à desaceleração abrupta, tais como o isolamento de células mononucleares do sangue periférico e centrifugações de gradiente, a travagem pode causar a remixagem de camadas separadas. Nesses casos, é mais adequado desligar o travão para que a desaceleração seja gradual e não perturbe os gradientes. Algumas centrifugadoras fornecem uma gama de ajustes de desaceleração. Isto pode ser útil quando as células de mamíferos em rotação, que são sensíveis a desacelerações súbitas mas, ao mesmo tempo, requerem alguma desaceleração para minimizar o tempo que a centrífuga leva a parar.
6. Onde está a centrífuga?
Uma das aplicações mais comuns da centrifugação é a de pellets, tais como células bacterianas, células de mamíferos, ou ácidos nucleicos. Enquanto se utiliza um rotor de ângulo fixo, o ângulo do rotor determina a posição do grânulo. Para garantir que sabe sempre onde está o seu grânulo, uma boa prática de laboratório é girar sempre os tubos com as dobradiças da tampa colocadas na mesma orientação (por exemplo, dobradiças da tampa viradas para o exterior). Isto é especialmente útil para evitar a perda de amostras durante as extracções de ADN quando o grânulo é quase invisível após a etapa de lavagem com etanol. No caso de rotores de balão, os grânulos formam-se principalmente no fundo do tubo.
Overall, espero que a leitura deste artigo o ajude a trabalhar com mais conforto e confiança com centrífugas. Se viu ou viveu um desastre com centrífugas, vá em frente e partilhe a sua história juntamente com quaisquer dicas e truques para garantir uma rotação feliz nos comentários abaixo. Que a força esteja convosco!
- Eppendorf. Segurança na centrifugação.
- Eppendorf. Condutibilidade térmica.
- Sigma. Temperatura de Amostra durante a Centrifugação de Temperatura Ambiente com Sigma 4-5L .
- Owen Mitch Griffith. Remisturas de Amostra durante Separações de Gradiente de Densidade com Fibra F21-8x50y mL de Rotor de Ângulo Fixo Thermo Scientific.
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