Bactérias a ganharem forma: Determinantes Genéticos da Morfologia de E. coli

OBSERVAÇÃO

Formas celulares bacterianas representam milhares de milhões de anos de refinamento evolutivo. O seu pequeno tamanho resulta em rácios de área/volume de superfície elevados, que são ideais para o transporte de nutrientes, respiração eficiente e manutenção da integridade estrutural. Sabe-se que a forma celular global é governada por uma riqueza de processos celulares e sugestões ambientais (1-3). No entanto, torna-se rapidamente um desafio identificar como as variações na forma das células têm impacto na função celular. Os dados à escala do genoma que descrevem as contribuições genéticas para a morfologia bacteriana são um passo no sentido de abordar esta questão. Além disso, as redes de interacção resultantes representam múltiplas redes biológicas interligadas resultantes de diferentes fenótipos de forma. Aqui, descrevemos uma fotografia genómica da morfologia de Escherichia coli K-12 na fase de média-exponencial utilizando a colecção de eliminação de Keio (4). Caracterizamos ainda as interacções genéticas entre as supressões com impacto na forma e o genoma E. coli utilizando a conjugação de alta produção (5, 6).

A plataforma de imagem de alto conteúdo que desenvolvemos é altamente adaptada para a complicada tarefa da imagem bacteriana. O tempo de imageamento de placas de micropoços de alta densidade (384 ou 1.536 poços) pode exceder em muito o tempo de aproximadamente 20 minutos de duplicação para E. coli, apresentando desafios temporais para as bibliotecas de imagens genómicas dentro de uma fase comum de crescimento. Além disso, a motilidade das células bacterianas vivas apresenta dificuldades adicionais na limitação da mobilidade das células durante a imagiologia microscópica. Combatemos estes desafios utilizando um fixador de glutaraldeído; um primeiro passo comum nas preparações de microscopia electrónica e conhecido por preservar a forma celular com impactos negligenciáveis na resolução da microscopia luminosa (7). As células foram então coradas negativamente em placas de imagem de fundo de vidro (0,17-mm de espessura) utilizando nigrosina e calor suavemente fixado com controlo de humidade, levando todas as células a um plano focal comum. Isto obviou a necessidade de contraste de fase, que era impraticável devido ao cone de luz do anel de fase ser bloqueado por arestas de poço em microplacas de 384 poços e de maior densidade. A utilização de um campo brilhante permitiu a passagem de mais luz através da amostra, resultando numa exposição mais rápida e numa melhor precisão focal. Placas preparadas desta forma podem ser reimplantadas indefinidamente, e a qualidade da imagem não se degrada com o tempo, facilitando a obtenção de imagens de elevado conteúdo de amostras que foram fixadas numa fase específica de crescimento. As imagens resultantes mostram um contraste intenso entre células e fundo, o que é altamente desejável para a imagiologia quantitativa (Fig. 1; totalmente detalhado no Texto S1 e Fig. S1 no material suplementar). Dez características morfológicas foram quantificadas por knockout: área, perímetro, eixo mínimo da elipse, comprimento mínimo de Feret, eixo principal da elipse, comprimento principal de Feret, circularidade, arredondamento, relação de aspecto, e solidez. Utilizámos então a análise dos componentes principais (PCA) como análise multiparamétrica e meio de redução da dimensionalidade (Fig. 1; Fig. S1). Isto deu-nos um meio completamente imparcial de classificação fenotípica após a aquisição. Os tratamentos com formas anormais foram revelados encaixando uma elipsóide em torno do conjunto de dados que representa a morfologia do tipo selvagem no espaço de componentes principais e seleccionando para os que se situam fora desta zona de corte. Os limites x, y, e z da elipsóide em cada dimensão correspondem a um corte de 3 componentes principais.

Desta forma, identificámos cerca de 111 mutantes de eliminação com defeitos de forma (ver Tabela S1 e Conjunto de Dados S1 no material suplementar). A nossa abordagem foi validada com a confirmação de vários mutantes de forma conhecidos, incluindo o mutante de eliminação tatA, anteriormente demonstrado ser longo e acorrentado devido à localização inadequada de amidases no periplasma (8). As mutações em holD, codificando a subunidade de DNA polimerase III ψ, são conhecidas por causar morfologias filamentosas em E. coli (9). De facto, a replicação de ADN tem uma relação síncrona com processos de divisão celular (10, 11), com rupturas na giroses de ADN que resultam em células alongadas com cromossomas únicos e sem septos (12). Curiosamente, a piridoxina 5′-phosphate oxidase, codificada por pdxH, gera piridoxal 5′-phosphate (PLP) e causou uma mudança para células longas, ocasionalmente encadeadas. A PLP é um cofactor chave no fornecimento de d-alanina e d-glutamato para a síntese de peptidoglicano de parede celular (13), e sabe-se que os mutantes pdxH têm um fenótipo filamentoso (14). Do mesmo modo, EnvC é um activador de enzimas remodeladoras da parede celular e é conhecido por causar crescimento filamentoso (15), e RodZ está envolvido na formação de paredes laterais e é conhecido por causar morfologia esférica (16). Estes fenótipos foram todos confirmados no nosso ecrã. Surpreendentemente, 52 genes na nossa lista codificam proteínas não caracterizadas em E. coli, sendo muitos deles putativos proteínas externas ou de membrana citoplasmática (Tabela S1). Assim, a plataforma de rastreio de alto conteúdo descreveu genes não essenciais envolvidos na manutenção da forma. Para melhor caracterizar e sondar os processos biológicos que interagem com estas mutações, optámos por preparar uma matriz de interacção genética com foco nestes genes de forma.

No total, 60 deleções correspondentes aos defeitos de forma mais fortes foram escolhidas como genes de consulta numa matriz genética sintética, 7 das quais não conjugaram bem utilizando a metodologia de Côté et al. (17). Isto resultou em 53 genes de forma de interesse da Tabela S1 serem sistematicamente cruzados (5, 6) com a colecção Keio, gerando 1,7 × 107 mutantes de dupla eliminação (ver Conjunto de Dados S2 no material suplementar) e uma rede de interacção sintética letal (ver Fig. S3 no material suplementar). Notámos que os mutantes com variações de forma mais extremas (por exemplo mutantes pdxH, rodZ, envC, e gpmM) não acasalaram correctamente em condições convencionais e exigiram acasalamento à temperatura ambiente durante um período de tempo prolongado. Quando os genes subjacentes às interacções letais sintéticas foram enriquecidos usando termos da Ontologia Genética (GO) para processos biológicos, os processos de transporte e de oxidação-redução foram sobre-representados (Fig. 2; Fig. S3). Isto foi baseado num histograma de frequência de ocorrência para cada termo GO, com ontologias acedidas utilizando o software EcoCyc (18) pathway-tools (19). Curiosamente, o canal externo de membrana TolC está presente com alta frequência, implicando uma relação entre a eficácia do sistema de efluxo de drogas (Acr, Mdt, Ent, Emr, e Mac) e a forma celular. O previsto YdjN de simetria, que ocorre mais frequentemente, está ainda implicado tanto no transporte de l-cisteína como na resposta ao stress oxidativo (20), processos biológicos coincidentemente enriquecidos na Fig. 2. De facto, os genes envolvidos nos processos redox estavam frequentemente ligados à respiração, tais como nos casos de ytfG, napG, cydB, nrdD, e nrdG. Isto é particularmente curioso dado que a forma/curvatura da membrana desempenha um papel na função proteica associada à membrana (21, 22), especialmente dadas as potenciais relações entre a eficácia da droga e a respiração celular (23, 24). Existe, contudo, uma compreensão limitada da ligação entre a forma celular (ou área de superfície) e a respiração. Testemunhámos uma notável preponderância de interacções dos genes da forma com os envolvidos nas funções respiratórias. Por exemplo, no trabalho de Côté et al. (17), 82 genes de stress de nutrientes foram cruzados com a colecção Keio e resultaram em menos de 200 interacções letais sintéticas com genes envolvidos em processos redox, enquanto que, em contraste, foram observadas cerca de 800 interacções deste tipo para 53 genes perturbadores da forma (Fig. 2).

Probing the Keio collection for gene deletions resulting in shape defects inesperadamente produziu uma riqueza de genes não caracterizados. A ligação destes genes com papéis na forma celular pode ajudar na classificação funcional a jusante, particularmente quando simultaneamente se traça o perfil das suas interacções genéticas. Em geral, os genes envolvidos na manutenção da forma parecem estar intrinsecamente ligados a processos biológicos como o transporte e a oxidação e redução, mas é necessário mais trabalho para clarificar a natureza das interacções observadas. De particular interesse é se as perturbações físicas, tais como a geometria da embalagem ou as variações de curvatura (21) acompanham os defeitos de forma. No entanto, a investigação aqui apresentada expande a nossa compreensão da complicada biologia que define a forma bacteriana. Além disso, a plataforma de microscopia de alto conteúdo aqui descrita é altamente modificável a qualquer biblioteca bacteriana genómica ou química.