William Howell Masters urodził się 27 grudnia 1915 roku w Cleveland, Ohio, jako syn Francisa Wynne’a i Estabrooks (Taylor) Masters. Uczęszczał do szkoły publicznej w Kansas City do ósmej klasy, a następnie uczęszczał do Lawrenceville School w Lawrenceville, New Jersey. W 1938 r. uzyskał tytuł B.S. w Hamilton College, gdzie dzielił swój czas między kursy naukowe i sporty, takie jak baseball, futbol i koszykówka. Brał również udział w debatach na kampusie. Wstąpił do University of Rochester School of Medicine i rozpoczął pracę w laboratorium doktora George’a Cornera, który porównywał i badał drogi rodne zwierząt i ludzi.
Na ostatnim roku studiów medycznych Masters zainteresował się seksualnością, ponieważ była to ostatnia niezbadana naukowo funkcja fizjologiczna. Po krótkiej służbie w marynarce wojennej, otrzymał tytuł magistra w 1943 roku. Masters zainteresował się pracą dr Alfreda Kinseya, profesora zoologii z Uniwersytetu Indiany, który przeprowadził wywiady z tysiącami mężczyzn i kobiet na temat ich doświadczeń seksualnych. Wybierając dziedzinę, która pomogłaby mu przygotować się do badań nad seksualnością człowieka, Masters został stażystą, a później rezydentem w dziedzinie położnictwa i ginekologii w St. Louis Hospital i Barnes Hospital w St. Odbył również staż w zakresie patologii w Washington University School of Medicine. W 1947 roku dołączył do grona wykładowców w Waszyngtonie i awansował z instruktora na profesora nadzwyczajnego położnictwa klinicznego i ginekologii. Masters prowadził badania w tej dziedzinie i opublikował dziesiątki prac w czasopismach naukowych. Jednym z obszarów jego zainteresowań było leczenie hormonalne i zastępcze u kobiet po menopauzie.
Do 1954 roku Masters zdecydował, że jest gotowy do podjęcia badań nad fizjologią seksu. Martwił się, że profesja medyczna miała zbyt mało informacji na temat seksualności, aby zrozumieć problemy klientów. Kinsey opierał się na historiach przypadków, wywiadach i danych z drugiej ręki. Masters podjął kolejny krok, którym było zbadanie ludzkiego pobudzenia seksualnego przy użyciu technologii pomiarowej w warunkach laboratoryjnych.
Masters rozpoczął swój projekt na Uniwersytecie Waszyngtońskim, wspomagany grantem z Instytutu Zdrowia Stanów Zjednoczonych. Początkowo rekrutował do badań prostytutki, ale uznał, że nie nadają się one do jego badań nad „normalną” seksualnością. W 1956 roku zatrudnił Virginię Eshelman Johnson, studentkę socjologii, do pomocy w przeprowadzaniu wywiadów i selekcji ochotników. Badania prowadzono przez jedenaście lat, wzięły w nich udział 382 kobiety i 312 mężczyzn. Wiek badanych wahał się od osiemnastu do osiemdziesięciu dziewięciu lat, a za ich czas płacono. Masters odkrył czterofazowy cykl odnoszący się do męskich i żeńskich reakcji seksualnych. Aby zmierzyć zmiany fizjologiczne, użył elektroencefalografów, elektrokardiografów, kolorowej kinematografii i badań biochemicznych.
Masters był bardzo ostrożny i skrupulatny w ochronie tożsamości swoich ochotników. W 1959 roku wysłał niektóre wyniki do czasopism medycznych, ale kontynuował pracę we względnej tajemnicy. Po tym, jak treść badań wyciekła, zespół miał trudności z uzyskaniem dotacji, więc w 1964 roku Masters został dyrektorem Reproductive Biology Foundation, grupy non-profit, aby uzyskać prywatne fundusze. W listopadzie tego samego roku, dr Leslie H. Farber, szanowany psychiatra z Waszyngtonu, napisał w Commentary artykuł zatytułowany „Przykro mi, kochanie”, w którym zaatakował „scjentyzację” seksu. Ten atak był tylko początkiem krytyki, jaką otrzymały badania.
W 1966 roku Masters i Johnson opublikowali Human Sexual Response. W tej książce badacze użyli bardzo technicznej terminologii i kazali swojemu wydawcy, Little, Brown and Co, promować książkę tylko wśród specjalistów medycznych i w czasopismach. Mimo to książka stała się popularną sensacją, a zespół wyruszył w trasę z wykładami i prelekcjami, zdobywając natychmiastową sławę. Już w 1959 roku Masters i Johnson zaczęli doradzać parom jako zespół dwupłciowy. Wierząc, że partnerzy będą czuli się bardziej komfortowo rozmawiając z terapeutą tej samej płci, zespół rozpoczął pracę z problemami seksualnymi par. W swojej drugiej książce, Human Sexual Inadequacy (1970), omawiają takie problemy jak impotencja.
Masters rozwiódł się ze swoją pierwszą żoną, Elisabeth Ellis, niedługo po opublikowaniu Human Sexual Inadequacy i poślubił Johnson 1 stycznia 1971 roku w Fayetteville, Arkansas. W 1973 roku zostali współdyrektorami Instytutu Mastersa i Johnsona. W 1979 roku Masters i Johnson przestudiowali i opisali reakcje seksualne homoseksualistów i lesbijek w książce Homoseksualizm w perspektywie. Twierdzili oni również, że są w stanie zmienić preferencje seksualne homoseksualistów, którzy tego chcą. Masters prowadził również laboratorium biochemiczne i nadal otrzymywał honoraria z praktyki ginekologicznej. Przeszedł na emeryturę w 1975 roku w wieku sześćdziesięciu lat. W 1981 roku Masters i Johnson sprzedali swoje laboratorium i przenieśli się do innej lokalizacji w St. Louis. W tym czasie zatrudniali 25 pracowników i mieli długą listę klientów terapii.
Dalsze kontrowersje wokół ich pracy pojawiły się, gdy w 1988 roku Masters i Johnson byli współautorami książki wraz ze swoim współpracownikiem, dr Robertem Kolodym. Książka „Crisis: Heterosexual Behavior in the Age of AIDS” przewidywała epidemię AIDS wśród populacji heteroseksualnej. Niektórzy członkowie społeczności medycznej ostro potępili badania, a C. Everett Koop, ówczesny chirurg generalny Stanów Zjednoczonych, nazwał Mastersa i Johnsona nieodpowiedzialnymi. Być może w wyniku negatywnego rozgłosu zmniejszyła się liczba klientów poszukujących terapii seksualnej w instytucie. Na początku 1992 roku Bill Walters, pełniący obowiązki dyrektora instytutu, ogłosił, że Masters i Johnson rozwodzą się po dwudziestu jeden latach małżeństwa – jako powód rozstania podano konflikt w ich wyobrażeniach o emeryturze. Masters przysięgał, że nigdy nie przejdzie na emeryturę i nadal mówił i wykładał w instytucie, pracując jednocześnie nad kolejną książką. Rozwód zakończył ich wspólną pracę w klinice.
Za swoje pionierskie wysiłki w uczynieniu ludzkiej seksualności przedmiotem badań naukowych Masters otrzymał nagrodę Paula H. Hocha od Amerykańskiego Stowarzyszenia Psychopatycznego w 1971 roku, nagrodę Rady Informacji i Edukacji Seksualnej Stanów Zjednoczonych (SIECUS) w 1972 roku i trzy inne prestiżowe nagrody. Należy do American Association for the Advancement of Science (AAAS), American Fertility Society i kilku innych stowarzyszeń medycznych.