W latach 1853-1860 Billroth był asystentem w klinice chirurgicznej Bernharda von Langenbecka w berlińskiej Charité. Tam też terminował u Carla Langenbucha. W 1860 r. Billroth przyjął propozycję z Uniwersytetu w Zurychu, aby objąć katedrę chirurgii klinicznej i zostać dyrektorem szpitala chirurgicznego i kliniki w Zurychu. Początki jego kariery w Szwajcarii nie były obiecujące: w pierwszym semestrze nauczania miał tylko dziesięciu studentów, a on sam twierdził, że dochody z prywatnej praktyki nie wystarczały na opłacenie porannej filiżanki kawy. Jednak jego reputacja szybko rosła; Billroth miał zaraźliwą osobowość, która przyciągała do jego szeregów zarówno studentów, jak i stażystów chirurgicznych. Był uwielbiany przez swoich studentów i był skutecznym nauczycielem zarówno na poziomie licencjackim, jak i magisterskim. Studenci tłumnie przychodzili na jego wykłady, a dzięki współpracy energicznych kolegów udało mu się w ciągu zaledwie kilku lat podnieść Wydział Medyczny w Zurychu do rangi czołowej wśród szkół niemieckojęzycznych.
Podczas pobytu w Zurychu Billroth opublikował swój klasyczny podręcznik Die allgemeine chirurgische Pathologie und Therapie (Ogólna patologia i terapia chirurgiczna) (1863). W tym samym czasie wprowadził pojęcie audytu, publikując wszystkie wyniki, dobre i złe, co automatycznie doprowadziło do uczciwej dyskusji na temat zachorowalności, śmiertelności i technik – a w rezultacie do poprawy doboru pacjentów.
W 1867 roku został mianowany profesorem chirurgii na Uniwersytecie Wiedeńskim, w zastępstwie Franza Schuha; praktykował tam chirurgię jako szef Drugiej Kliniki Chirurgicznej w Allgemeine Krankenhaus (Wiedeński Szpital Ogólny). Choć podstawy swojej sławy położył w Zurychu, to właśnie w Wiedniu, w większym i bardziej widocznym teatrze, ugruntował swoją pozycję jako potęga w świecie chirurgicznym. Przemówienie, które wygłosił w 1875 roku, protestując przeciwko napływowi żydowskich studentów medycyny, jest uważane za jedno z pierwszych wydarzeń w rozwoju wiedeńskiego politycznego antysemityzmu.
Podczas wojny francusko-pruskiej Billroth wykonywał wspaniałą pracę w szpitalu wojskowym w Mannheim i Weissenburgu, lecząc różne przerażające urazy z pola bitwy za pomocą agresywnych i ambitnych operacji; swoje doświadczenia z chirurgii wojennej zawarł w Listach chirurgicznych z Mannheim i Weissenburga. Okropności wojny wywarły na nim tak wielkie wrażenie, że do końca życia był gorącym orędownikiem pokoju. W dniu 3 grudnia 1891 r. wygłosił przemówienie na temat opieki nad rannymi w czasie wojny, które wzbudziło ogromną sensację i doprowadziło do przegłosowania przez austriackie izby ustawodawcze dużych sum pieniędzy na zapewnienie odpowiednich środków pomocy dla rannych.
Nie ograniczał się tylko do chirurgii i prowadził szeroko zakrojone badania nad dolegliwością, która dotykała wówczas wielu pacjentów chirurgii: gorączką ran. W swojej rozprawie na temat gorączki ran, Untersuchungen über die Vegetationsformen von Coccobacteria septica (1874; „Badania nad formami wegetatywnymi Coccobacteria septica”), doszedł do wniosku, że przyczyną były bakterie; Billroth szybko zaczął stosować techniki antyseptyczne w swojej praktyce chirurgicznej, a liczba pacjentów chirurgicznych dotkniętych gorączką ran znacznie się zmniejszyła. Z groźbą śmiertelnych zakażeń chirurgicznych, zmniejszoną dzięki jego pracy i pracy innych, Billroth zajął się chirurgią i pionierską dziedziną zmiany lub usuwania narządów, które wcześniej uważano za niedostępne.
Wczesne zastosowanie „białego fartucha” (jak pokazano na obrazie Seligmanna z ok. 1890 r.) było dla Billrotha bezpośrednią przyczyną śmierci. Billroth był bezpośrednio odpowiedzialny za wiele przełomowych momentów w chirurgii; w 1872 r. jako pierwszy przeprowadził ezofagektomię, usuwając część przełyku i łącząc pozostałe części. W 1873 r. wykonał pierwszą laryngektomię, całkowicie usuwając raka krtani. Był pierwszym chirurgiem, który usunął raka odbytnicy, a do 1876 r. przeprowadził 33 takie operacje. Do 1881 roku Billroth sprawił, że chirurgia jelitowa stała się niemal powszechna. Jednak jego najsłynniejszym osiągnięciem jest bezsprzecznie pierwsza udana gastrektomia z powodu raka żołądka. 29 stycznia 1881 roku, po wielu nieudanych próbach, Billroth wykonał pierwszą udaną resekcję z powodu raka antralnego żołądka u Therese Heller, która żyła prawie 4 miesiące i zmarła z powodu przerzutów do wątroby. Operację tę przeprowadził zamykając stronę krzywizny większej żołądka i zespalając krzywiznę mniejszą z dwunastnicą, co do dziś znane jest pod nazwą Billroth I.
Billroth prowadził szeroką działalność literacką, a łączna liczba opublikowanych książek i prac, których był autorem, wynosiła około stu czterdziestu. Wspólnie z Franzem von Pitha opracował podręcznik chirurgii ogólnej i specjalnej (1882). Billroth wniósł do niego rozdziały o skrofuły i gruźlicy, urazach i chorobach piersi, narzędziach i operacjach, oparzeniach, odmrożeniach itp.
Billroth przekazał swojego niespokojnego ducha intelektualnego licznym wybitnym uczniom, tworząc „Szkołę Billrotha” naśladowców. Żaden aspekt jego zawodu nie umknął jego intensywnej obserwacji, niezależnie od tego, czy chodziło o badania naukowe, nauczanie, administrację, czy pielęgniarstwo. O każdym z nich miał nie tylko coś wartościowego do powiedzenia, ale często dbał o to, aby jego idee stały się konkretną rzeczywistością. We wszystkich sferach, na które starał się wpływać, kierował się wiarą w jedność nauki i sztuki oraz wiarą we własną zdolność do wprowadzania zmian.
Billroth odegrał zasadniczą rolę w ustanowieniu pierwszej nowoczesnej szkoły myślenia w chirurgii. Miał radykalne poglądy na temat szkolenia chirurgicznego, opowiadając się za przedłużonym stażem chirurgicznym po ukończeniu studiów medycznych, polegającym na wstępnej pracy w szpitalach, a następnie wykonywaniu operacji na zwłokach i zwierzętach doświadczalnych. Następnie 2-3 letni staż asystencki na oddziale chirurgicznym połączony ze studiowaniem literatury chirurgicznej i nabywaniem zaawansowanych umiejętności praktycznych. Wśród jego uczniów byli tacy luminarze, jak Alexander von Winiwarter, Jan Mikulicz-Radecki i John B. Murphy. Pionierski program rezydentury chirurgicznej Williama Halsteda był pod dużym wpływem metod edukacji chirurgicznej Billrotha.