Test Biuretowy dla Białka

Ostatnio aktualizowany 5 maja 2020 przez Sagar Aryal

Co oznacza test Biuretowy?

Białka są złożonym związkiem utworzonym przez tysiące aminokwasów. Aminokwasy są amfoterycznymi elektrolitami posiadającymi grupy karboksylowe i aminowe, które działają jak kwas i zasada. Posiadają jeden ładunek dodatni i jeden ujemny, stąd jony te są elektrycznie obojętne i nie migrują w polu elektrycznym. Dwa aminokwasy połączone są ze sobą za pomocą wiązania zwanego wiązaniem peptydowym i w ten sposób powstaje dipeptyd. Wiązanie to tworzy się pomiędzy grupą aminową α jednego aminokwasu a grupą karboksylową α drugiego aminokwasu z usunięciem cząsteczki wody. Powstawanie wiązania peptydowego nazywamy reakcją kondensacji. Podobnie trzy aminokwasy połączone ze sobą dwoma wiązaniami peptydowymi nazywamy tripeptydem, a w miarę wydłużania się łańcucha – polipeptydem. Biuret jest związkiem powstającym w wyniku ogrzewania mocznika w temperaturze 1800, co powoduje kondensację 2 cząsteczek mocznika. Wiązania peptydowe w Biurecie dają pozytywny wynik testu, stąd nazwa odczynnika. Jest on uważany za ogólny test dla związków (białek i peptydów) posiadających dwa lub więcej wiązań peptydowych (CO-NH).

Cele

• Wykrywanie białka w podanym roztworze.
• Wykazać obecność wiązania peptydowego.

Zasada testu biuretowego (Jak działa test biuretowy?)

Test biuretowy jest testem chemicznym używanym do określenia obecności wiązania peptydowego w substancji. Opiera się na reakcji biuretowej, w której struktura peptydowa zawierająca co najmniej dwa ogniwa peptydowe wytwarza fioletowe zabarwienie po potraktowaniu alkalicznym siarczanem miedzi. W obecności alkalicznego roztworu, niebiesko zabarwiony jon miedzi II może tworzyć kompleks z wiązaniami peptydowymi, ponieważ peptyd posiada nieudzielone pary elektronowe w azocie i tlenie wody. Kolorowy kompleks koordynacyjny tworzy się pomiędzy jonem Cu2+ a tlenem karbonylowym (>C=O) i azotem amidowym (=NH) wiązania peptydowego. Po utworzeniu się tego kompleksu roztwór zmienia barwę z niebieskiej na fioletową. Im głębszy jest kolor fioletowy, tym większa jest liczba kompleksów peptyd-miedź. Reakcja zachodzi w każdym związku zawierającym co najmniej dwie grupy H2N-C, H2N-CH2-, H2N-CS- lub podobne, połączone ze sobą bezpośrednio lub poprzez atom węgla lub azotu. Jeden jon miedzi jest prawdopodobnie połączony wiązaniami koordynacyjnymi z 6 pobliskimi wiązaniami peptydowymi. Intensywność barwy jest wprost proporcjonalna do liczby wiązań peptydowych obecnych w cząsteczce białka, która wchodzi w reakcję, a także do liczby cząsteczek białka obecnych w układzie reakcyjnym.

Odczynnik Biureta jest roztworem składającym się z wodorotlenku sodu (NaOH) lub wodorotlenku potasu (KOH), uwodnionego siarczanu miedzi (II) i winianu sodowo-potasowego. Wodorotlenek sodu i wodorotlenek potasu dostarczają medium alkalicznego, a winian sodowo-potasowy jest dodawany w celu chelatowania i tym samym stabilizacji jonów miedzi w roztworze lub utrzymania ich rozpuszczalności w roztworze alkalicznym.

Procedura testu Biureta

• Pobierz 3 czyste i suche probówki testowe.
• Dodaj 1-2 ml roztworu testowego, albuminy jaja i dejonizowanej wody do odpowiednich probówek testowych.
• Dodaj 1-2 ml odczynnika Biureta do wszystkich probówek testowych.
• Dobrze wstrząsnąć i pozostawić mieszaniny na 5 minut.
• Obserwować czy nie nastąpiła zmiana koloru.

Wyniki testu biuretowego

Obserwacja	Interpretacja
Brak zmiany koloru, i.e., roztwór pozostaje niebieski	Białka są nieobecne (ujemny test biuretowy)
Roztwór zmienia barwę z niebieskiej na głęboko fioletową	Białka są obecne (pozytywny test biuretowy)

Test biuretowy Zastosowanie

1. Może być stosowany do wykrywania ilości białka w moczu.
2. Reakcja biuretowa z białkiem ma zastosowanie do ilościowego oznaczania białka całkowitego za pomocą analizy spektrofotometrycznej.

1. Shrestha B (2002). Praktyczna biochemia i biotechnologia. Pierwsze wydanie. 99933-665-1-X.
2. Chemistry Learner (https://www.chemistrylearner.com/biuret-test.html).
3. Satyanarayana U i Chakrapani U (2006). Biochemistry. Uppala Author-Publisher Interlink. Wydanie trzecie. Page no. 43-67.
4. https://study.com/academy/lesson/what-does-biuret-test-for-method-equation.html.

Źródła internetowe

• 2% – https://www.slideshare.net/jammalavamsikrishna/amino-acids-71579203
• 2% – https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/biuret
• 2%. – https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0009898175903514
• 2% – https://peptidesciences.com/information/peptide-bonds/
• 10% – https://onlinesciencenotes.com/biuret-test-principle-requirements-procedure-and-result-interpretation/
• 1% – https://onlinesciencenotes.com/biuret-test-principle-requirements-procedure-and-result-interpretation/
• 1% – https://quizlet.com/18722031/biology-chapter-5-flash-cards/
• 1% – https://microbiologyinfo.com/benedicts-test-principle-composition-preparation-procedure-and-result-interpretation/
• 1% – https://brainly.in/question/716138
• 1% – http://amrita.olabs.edu.in/?sub=79&brch=17&sim=205&cnt=1
• <https://education.jlab.org/qa/charges_01.html