Konwencjonalne sieciowanie kolagenu
Konwencjonalna procedura CXL opisana w protokole drezdeńskim w 2003r, jego zmodyfikowanej wersji z 2008 roku oraz protokole ze Sieny, dotyczy rogówek o minimalnej grubości zrębu 400 μm i polega na usunięciu środkowych 7-9 mm nabłonka rogówki, a następnie podaniu izoosmolarnego roztworu ryboflawiny 0.1 % roztworu w 20 % dekstranie. Po nasyceniu zrębu ryboflawiną rozpoczyna się naświetlanie UVA (370 nm) o mocy 3 mW/cm2 przez 30 minut (5,4 J/cm2) centralnej części rogówki o średnicy 8 mm. Skuteczność tego protokołu jest poparta licznymi badaniami od czasu jego wprowadzenia w 2003 roku .
Kymionis i wsp. zastosowali konwencjonalną procedurę CXL w 14 cienkich rogówkach o minimalnej grubości rogówki mniejszej niż 400 μm (zakres 340-399 μm) po usunięciu nabłonka. W trakcie 12-miesięcznej obserwacji odnotowano poprawę nieskorygowanej ostrości wzroku na odległość (UDVA), skorygowanej ostrości wzroku na odległość (CDVA) oraz redukcję średniego odczytu keratometrii. Jednak pomimo braku klinicznie jawnych powikłań, po zabiegu obserwowano istotne zmniejszenie gęstości komórek śródbłonka z 2733 do 2411 komórek/mm2. Grubość warstwy 0,1% izoosmolarnej ryboflawiny z 20% dekstranem została zmierzona na około 70 μm po 1 minucie od podania i pozostała stabilna przez 22 minuty. W przypadku folii ryboflawina-dekstran zmierzono, że natężenie promieniowania UVA w ludzkim zrębie rogówki przy grubości 400 μm wynosi 0,21 mW/cm2 , co jest znacznie niższe niż wspomniany wcześniej poziom cytotoksyczności, na którym opiera się ustalone ograniczenie minimalnej grubości zrębu do 400 μm. Zatem absorpcja i ekranowanie UVA przez folię ryboflawinową mogły zapobiec uszkodzeniu śródbłonka. Niemniej jednak, dłuższa obserwacja i większe serie pacjentów są niezbędne do oceny bezpieczeństwa i skuteczności konwencjonalnej CXL w klinicznym zastosowaniu w cienkich rogówkach.
Hipoosmolarny roztwór ryboflawiny
Rogówka ma obojętne ciśnienie pęcznienia, co oznacza, że zrąb rogówki ma tendencję do zwiększania swojej objętości w środowisku izoonkotycznym. The deepithelialized rogówka może pęcznieć do podwojenia swojej normalnej grubości, gdy jest nawadniana hipoosmolarnym roztworem. Hafezi i współautorzy zastosowali tę metodę do zwiększenia grubości rogówki przed CXL w cienkich rogówkach. Po usunięciu nabłonka, 0,1-20 % dekstran izoosmolarny ryboflawiny był nakładany na rogówkę przez 30 minut. Następnie podawano 0,1% hipoosmolarną ryboflawinę bez dekstranu, aż grubość rogówki w najcieńszym miejscu osiągnęła 400 μm, przed rozpoczęciem naświetlania UVA. Autorzy donieśli o stabilizacji keratektazji w 20 oczach leczonych tym sposobem. W późniejszym badaniu Raiskup i wsp. stosowali 0,1% hipoosmolarną ryboflawinę po usunięciu nabłonka, aż rogówka nasycona ryboflawiną osiągnęła minimum 400 μm. W badaniu tym, rok po leczeniu, CDVA i wartość keratometryczna pozostały niezmienione i nie zarejestrowano uszkodzenia rogówki w postaci wykrywalnych zmian bliznowatych w zrębie. Podobne wyniki uzyskali Wu i wsp. Przeciwnie, w oczach leczonych izoosmolarnym roztworem ryboflawiny, w cienkich rogówkach po CXL występowała tendencja do powstawania trwałej blizny zrębu. Gu i wsp. zastosowali 0,1% hipoosmolarny roztwór ryboflawiny jako roztwór nasycający i pęczniejący w 8 cienkich rogówkach poddanych zabiegowi CXL. Odnotowali oni nieznaczne zmniejszenie gęstości komórek śródbłonka 3 miesiące po zabiegu.
Przedoperacyjny obrzęk rogówki rozszerza spektrum wskazań do CXL na cieńsze rogówki. Jednak Hafezi i współpracownicy opisali przypadek, w którym CXL nie mogła zatrzymać progresji keratoconus w bardzo cienkiej rogówce (minimalna grubość 268 μm po usunięciu nabłonka), mimo że spęcznianie hipoosmolarnym roztworem ryboflawiny zwiększyło grubość do 406 μm i nie obserwowano niekorzystnej reakcji śródbłonka po zabiegu. Autorzy wysunęli więc hipotezę, że istnieje minimalna, nieokreślona jeszcze grubość zrębu niezbędna do wystąpienia skutecznej CXL. Zasugerowali, że minimalna grubość zrębu przed obrzękiem, przy zastosowaniu hipoosmolarnego roztworu ryboflawiny, powinna wynosić 330 μm lub więcej.
Kaya i wsp. oraz Soeters i wsp. przeprowadzili śródoperacyjne pomiary grubości rogówki podczas CXL z zastosowaniem hipoosmolarnego roztworu ryboflawiny w cienkich rogówkach. Stwierdzili, że efekt sztucznego pęcznienia był przejściowy, a najcieńsze odczyty pachymetryczne zmniejszyły się znacząco po 10 i 30 minutach aplikacji izoosmolarnej ryboflawiny (z dekstranem), z lub bez napromieniowania UVA. Rozcieńczenie głęboko zrogowaciałej rogówki po podaniu 0,1-20% izoosmolarnego roztworu dekstranu ryboflawiny było również opisywane w innych badaniach. Autorzy wywnioskowali, że zmniejszenie grubości rogówki było wywołane hiperonkotycznym działaniem dekstranu. Vetter i wsp. oceniali modulujący wpływ różnych składów ryboflawiny 0,1 i 0,2% na centralną grubość rogówki w świeżych, pośmiertnych oczach świńskich. Nie zaobserwowano korelacji pomiędzy osmolarnością kompozycji a zachowaniem pęczniejącym leczonych rogówek, natomiast zweryfikowano odwrotną korelację pomiędzy stężeniem dekstranu a efektem pęcznienia. Jednocześnie, niższy efekt absorpcji i osłony cieńszego hipoosmolarnego filmu ryboflawiny na rogówce, poprzez zastosowanie hipoosmolarnej ryboflawiny bez samego dekstranu, zwiększyłby poziom napromieniowania w zrębie, narażając śródbłonek na większe ryzyko. Dlatego rogówka powinna być spuchnięta do grubości większej niż 400 μm lub stężenie ryboflawiny w hipoosmolarnym roztworze mogłoby być zwiększone. Zasugerowano zatem, że opracowanie nowych roztworów ryboflawiny o właściwościach izoonkotycznych, tworzących stabilny film, mogłoby zwiększyć bezpieczeństwo CXL. Ponadto, brak odporności na parowanie zapewnianej przez nabłonek rogówki i/lub wzrost aktywności pompy śródbłonkowej może również przyczynić się do ścieńczenia rogówki. Zaproponowano, że usunięcie wziernika powiek podczas nasycania ryboflawiną oraz zastosowanie urządzeń napromieniowujących o krótszym czasie napromieniania (i wyższej mocy) może być korzystne. Istotne może być również monitorowanie grubości rogówki w trakcie leczenia CXL. Można oczekiwać, że CXL będzie miała mniejszy wpływ na biomechanikę sztucznie obrzękniętej rogówki ze względu na niższe względne stężenie kolagenu w uwodnionym zrębie.
Substancje takie jak chlorek benzalkonium, kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i trometamol, zwłaszcza w połączeniu, zwiększają przepuszczalność nabłonka dla hydrofilnych makrocząsteczek, takich jak ryboflawina. Poprzez dodanie substancji wzmacniających, które ułatwiają przenikanie ryboflawiny do zrębu rogówki przez nienaruszony nabłonek, można wykonać CXL bez usuwania nabłonka (transepithelial CXL). Zaproponowano (ale nie udowodniono), że przezbłonkowa CXL zmniejsza wczesny ból pooperacyjny, tymczasowe pogorszenie widzenia, jak również powikłania takie jak infekcyjne zapalenie rogówki po konwencjonalnej CXL. Dodatkowo, cieńsze rogówki mogą być leczone bezpieczniej za pomocą transepithelial w porównaniu do konwencjonalnego CXL, ponieważ śródbłonek jest lepiej chroniony przez UVA-filtrujący efekt nienaruszonego nabłonka.
W dwustronnym badaniu, Filippello i wsp. użyli trometamolu i sodu EDTA jako środków wzmacniających i zastosowali transepithelial CXL w 20 zrogowaciałych oczach ze średnią grubością rogówki (włączając nabłonek) 412 ± 21 μm . Przezbłonkowa terapia CXL zatrzymała progresję keratoconus we wszystkich leczonych oczach w ciągu 18 miesięcy obserwacji. Uzyskano również statystycznie istotną poprawę we wszystkich wizualnych i topograficznych miarach wyniku, podczas gdy w kontralateralnych, nieleczonych oczach stwierdzono pogorszenie wszystkich parametrów. Spadea i wsp. , którzy zastosowali podobny protokół w cienkich rogówkach, potwierdzili jego efekt w stabilizacji rogówki. Poprawa wizualna i topograficzna była jednak minimalna. W żadnym z badań nie zaobserwowano uszkodzenia komórek śródbłonka.
Wollensak i wsp. oszacowali 64-procentowy wzrost sztywności rogówki w ludzkich rogówkach przy zastosowaniu przeznabłonkowej CXL z użyciem środków miejscowo znieczulających i chlorku benzalkoniowego jako środków wzmacniających, w porównaniu z 320-procentowym wzrostem przy zastosowaniu CXL z deepitelializacją. Bezpieczeństwo i powtarzalność badania przeprowadzonego przez Filippello i wsp. zostały ostatnio zakwestionowane, ponieważ głębokość pooperacyjnej linii demarkacyjnej w ich badaniu wynosiła tylko około 100 μm, w przeciwieństwie do około 300 μm w konwencjonalnym CXL z deepitalizacją nabłonka. Seiler i Hafezi po raz pierwszy opisali linię demarkacyjną po CXL i odnieśli głębokość linii do śmierci keratocytów po CXL, mierzonej za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zasugerowali, że linia ta reprezentuje strefę przejściową pomiędzy usieciowanym zrębu przedniego i nie poddanego obróbce zrębu tylnego. Nie jest jasne, czy płytsza linia demarkacyjna przy zastosowaniu metody transepitelialnej wynikała z ograniczonej penetracji ryboflawiny do zrębu, czy też była wynikiem zmniejszonej penetracji promieniowania UVA przez osłonę z impregnowanego ryboflawiną nienaruszonego nabłonka rogówki. W celu zwiększenia penetracji ryboflawiny do zrębu rogówki opracowano niedawno system transepitelialnego CXL wspomaganego jonoforezą, wykorzystujący nieinwazyjny system dostarczania leku oparty na niewielkim prądzie elektrycznym. Wyniki przedkliniczne wykazały, że jonoforeza była w stanie zwiększyć stężenie ryboflawiny w zrębie rogówki w porównaniu do wspomaganego wzmacniaczem transepitelialnego CXL, ale nie osiągnęła stężeń wcześniej osiąganych przy konwencjonalnym wyłączonym nabłonku CXL. Linia demarkacyjna po przeznabłonkowej CXL wspomaganej jonoforezą okazała się mniej łatwa do odróżnienia i płytsza niż w konwencjonalnej CXL, jednak pod względem głębokości i wizualizacji wykazywała cechy bardziej zbliżone do linii po konwencjonalnej CXL w porównaniu z przeznabłonkową CXL wspomaganą enhancerem. Ogólnie rzecz biorąc, w środowisku naukowym panuje zgoda co do tego, że obecne protokoły transepitelialne CXL nie są tak skuteczne, jak konwencjonalne CXL z wyłączonym nabłonkiem .
Technologia niestandardowego usuwania nabłonka
Kymionis i wsp. przeprowadzili CXL z niestandardowym usuwaniem nabłonka pod kontrolą pachymetrii w jednym oku keratokonicznym i jednym oku po zabiegu keratektomii LASIK z najcieńszym zrębu mniejszym niż 400 μm. W tym zmodyfikowanym podejściu CXL usunięto nabłonek rogówki o średnicy 8,0 mm, pozostawiając mały, zlokalizowany obszar nabłonka rogówki odpowiadający najcieńszemu obszarowi nad wierzchołkiem stożka. Autorzy sugerowali stosowanie hipoosmolarnej ryboflawiny podczas naświetlania UVA w celu uniknięcia odwodnienia zrębu rogówki, jak również w celu utrzymania stężenia ryboflawiny w zrębie. Dziewięć miesięcy po operacji topografia rogówki pozostała stabilna, a w leczonych oczach nie stwierdzono zmian gęstości komórek śródbłonka. Jednakże późniejsze badanie Kaya i wsp. sugerowało, że nabłonek nad obszarem stożka oszczędzał zrąb znajdujący się pod nim przed efektem CXL. Cztery tygodnie po zabiegu, zamglenie zrębu i linia demarkacyjna zostały wykryte w obszarach rogówki z usuniętym nabłonkiem, ale nie w obszarach z nienaruszonym nabłonkiem; głęboko zdefektowany zrąb poza obszarem stożka wykazywał całkowitą apoptozę keratocytów i obrzęk przypominający plaster miodu, podczas gdy był minimalny pod nienaruszonym nabłonkiem. W przeciwieństwie do tego, Mazzotta i wsp. wykazali apoptozę keratocytów na średniej głębokości 160 μm pod wyspą nabłonka w porównaniu do 250 μm pod obszarem zdepitelizowanym w 10 oczach z 1-letnią obserwacją.
Jedno z poprzednich badań wykazało, że absorpcja ryboflawiny przez zrąb po zastosowaniu siatki do usuwania pełnej grubości nabłonka była niejednorodna, z pełną penetracją do zrębu bezpośrednio pod obszarami usuwania nabłonka i brakiem penetracji do zrębu pod nienaruszonym nabłonkiem. Niewystarczające nasycenie ryboflawiną wraz ze zdolnością nabłonka do pochłaniania promieniowania UVA może prowadzić do zmniejszenia efektu CXL w obszarze stożka i wpływać na skuteczność całej procedury. Długoterminowa skuteczność tej zmodyfikowanej procedury CXL na większej liczbie pacjentów wymaga oceny.
Soczewki kontaktowe wspomagane sieciowaniem kolagenu
Soczewki kontaktowe wspomagane CXL (CACXL) zostały wprowadzone przez Jacoba i wsp. Jednodniowa miękka soczewka kontaktowa Soflens (średnica 14 mm, krzywizna podstawna 8.6 mm basal curvature; Bausch & Lomb) o grubości 90 μm wykonana z hilafilconu i bez filtra UV była zanurzona w izoosmolarnej ryboflawinie 0,1% w dekstranie przez 30 minut, zanim została nałożona na głęboko zitelializowaną, nasyconą ryboflawiną rogówkę. Naświetlanie promieniami UVA o mocy 3,0 mW/cm2 przez 30 minut rozpoczynano po potwierdzeniu, że minimalna grubość rogówki łącznie z soczewką kontaktową i warstwą ryboflawiny była większa niż 400 μm. Roztwór ryboflawiny był podawany co 3 minuty podczas naświetlania UVA w celu utrzymania nasycenia rogówki i utrzymania jednolitego filmu ryboflawiny przed rogówką i przed soczewką kontaktową. Przedtorebkowy film ryboflawinowy z soczewką kontaktową tworzył medium absorpcyjne w przestrzeni przedtorebkowej poprzez sztuczne zwiększenie grubości „filtra ryboflawinowego”.
W 14 oczach leczonych CACXL, autorzy odnotowali średni wzrost minimalnej grubości rogówki o 108 μm, jeśli uwzględnić soczewkę kontaktową i film ryboflawinowy. W średnim okresie obserwacji wynoszącym 6,1 ± 0,3 miesiąca (zakres: 6-7 miesięcy), średnia pooperacyjna głębokość linii demarkacyjnej zrębu została zmierzona na 252,9 μm. Nie obserwowano istotnego ubytku śródbłonka ani oznak pooperacyjnego uszkodzenia śródbłonka. Nie stwierdzono istotnych zmian w CDVA, ani średniej maksymalnej wartości keratometrycznej po zabiegu, chociaż w 4 oczach (28,5%) zaobserwowano zmniejszenie maksymalnej wartości keratometrycznej o 1 D.
Zaletą CACXL jest to, że nie jest on zależny od właściwości pęczniejących rogówki, a rogówka nie jest narażona na obrzęk, który może powodować fałdy błony Descemeta i uszkodzenie śródbłonka. Jednakże, powierzchniowe natężenie promieniowania na poziomie zrębu rogówki jest zredukowane o 40-50% w CACXL wtórnie do absorpcji przez błonę ryboflawinową i nasączoną soczewkę kontaktową. Ponadto, dyfuzja tlenu, która jak wykazano jest kluczowa w procesie CXL, może być utrudniona przez soczewkę kontaktową. W rezultacie efekt CXL może być zmniejszony. Ograniczeniem badania jest mała populacja pacjentów, krótka obserwacja i brak grupy kontrolnej.