W 1993 roku, kiedy Santoro studiował dziennikarstwo na PUC-Rio, wstąpił do Warsztatów Aktorskich Rede Globo. Santoro poszedł na grać role w wielu telenowelach Globo, takich jak Olho no Olho (1993), Pátria Minha (1994), Explode Coração (1995), O Amor Está no Ar (1997), Suave Veneno (1999) i Mulheres Apaixonadas (2003), a także miniserial Hilda Furacão (1998), w roli księdza. Santoro był również aktorem głosowym tytułowego bohatera Stuarta Małego i jego sequela w brazylijskich dubbingowanych kopiach.
Jego pierwsza poważna rola w produkcji kinowej pojawiła się w 2001 roku, w filmie Bicho de Sete Cabeças (Burza mózgów) brazylijskiego reżysera Laísa Bodansky’ego. Pod koniec filmu otrzymał owację na stojąco od publiczności. Zdobył też nagrodę dla najlepszego aktora festiwalu. Po Bicho, jego reputacja jako aktora została ugruntowana i został obsadzony w głównej roli męskiej w filmie Abril Despedaçado (Behind the Sun), jednym z nominowanych do nagrody Złotego Globu 2002 w kategorii najlepszy film zagraniczny. W 2003 roku w filmie Hectora Babenco Carandiru zagrał Lady Di, transseksualnego więźnia.
Kanadyjski reżyser Robert Allan Ackerman podpisał z Santoro kontrakt na produkcję telewizyjną The Roman Spring of Mrs. Stone, po tym jak został zahipnotyzowany jego występem w Bicho de Sete Cabeças. Ponieważ Santoro nie miał agenta w Ameryce Północnej, Ackerman skontaktował się z ojcem Santoro. Spędził dwa miesiące kręcąc filmy w Rzymie, u boku znanych aktorów, takich jak Helen Mirren i Anne Bancroft. Wkrótce po zakończeniu zdjęć do „Pani Stone”, otrzymał propozycję od Columbia Pictures dotyczącą roli w przeboju kinowym „Aniołki Charliego: Full Throttle. Występ w „Aniołkach Charliego” zapoczątkował jego karierę w Hollywood. Po Aniołkach Charliego, zagrał postać Karla, enigmatycznego głównego projektanta i miłosnego zainteresowania postaci Laury Linney, w komedii romantycznej Love Actually, w której wystąpili również Colin Firth, Lucia Moniz, Hugh Grant, Emma Thompson, Keira Knightley i Rowan Atkinson.
Zaczął również zdobywać pracę w branży reklamowej, pojawiając się w kampanii reklamowej z Gisele Bündchen w 2002 roku. Zagrał główną rolę męską w No. 5 The Film, 3-minutowej reklamie dla Chanel, wyreżyserowanej przez Baza Luhrmanna u boku Nicole Kidman w 2004 roku.
W 2006 roku Santoro dołączył do obsady serialu Lost jako ocalały z lotu Oceanic 815, Paulo. Jego pierwsze pojawienie się było w odcinku zatytułowanym „Further Instructions”. Jego postać została uśmiercona w odcinku „Exposé”. W portugalskim dubbingu dla Brazylii również podkłada głos pod swoją postać Paulo.
Santoro został obsadzony w roli perskiego cesarza Kserksesa w filmie 300, opartym na komiksie Franka Millera o tej samej nazwie, w 2006 roku. Rola miała wiele specjalnych wymagań, takich jak intensywny trening fizyczny (Santoro stracił 24 funty, aby pracować w brazylijskim miniserialu), obszerna praca CG, aby przedstawić 6’2″ Santoro jako 7-metrowego Boga-Króla, czteroipółgodzinny proces aplikacji makijażu i całkowite usunięcie owłosienia Santoro najpierw przez woskowanie, a następnie przez golenie, gdy okazało się to zbyt bolesne. Jego brwi pozostały nienaruszone, jednak zostały pokryte protezami i narysowane, a nie zgolone. Santoro czytał dzieła Herodota, starożytnego greckiego historyka, aby przygotować się do swojej roli. Jeśli chodzi o Kserksesa, stwierdził on:
Jest bogaty, arogancki, jest bardzo niestabilnym megalomanem. Chce po prostu podbić świat. Jego ambicja jest nieograniczona. Chce chwały, chce zwycięstwa, chce wiecznej sławy. Pod tym wszystkim jest jednak słaby i bardzo niepewny siebie.
Dla swojej roli w 300, Santoro stał się pierwszym brazylijskim aktorem nominowanym do MTV Movie Awards w kategorii Best Villain. Nie wygrał jednak, a nagroda powędrowała do Jacka Nicholsona za film The Departed.
Zagrał zmarłego piłkarza Heleno de Freitas w filmie Heleno z 2012 roku. Santoro wystąpił u boku Arnolda Schwarzeneggera w filmie The Last Stand z 2013 roku. Santoro zagrał Garrigę w filmie dramatycznym Willa Smitha Focus (2015).
Santoro zagrał Jezusa w historycznym filmie akcji Ben-Hur z 2016 roku i otrzymał osobiste błogosławieństwo od papieża Franciszka na tę rolę.
W tym samym roku zagrał Jezusa w filmie Ben-Hur.