Źródło próbek ludzkich
Łącznie 133 embriony ludzkie w stadium 2PN użyte w obecnym badaniu zostały uzyskane z RENEW Biobank Uniwersytetu Stanforda, z pisemną świadomą zgodą, że zostały one przekazane do badań nie związanych z zarodkami. Wszystkie embriony zostały zamrożone w stadium zygotycznym lub 2PN i jest bardzo prawdopodobne, że reprezentują one typową populację IVF, ponieważ nie były selekcjonowane przed kriokonserwacją. De-identyfikacja została przeprowadzona zgodnie z protokołem „The RENEW Biobank”, który został zatwierdzony przez Stanford University Institutional Review Board. Z embrionami nie były związane żadne chronione informacje zdrowotne. Spośród 133 rozmrożonych zarodków, 91 okazało się żywych po rozmrożeniu, a reszta została wykluczona, ponieważ nie były widocznie zdolne do życia (przed aspiracją mikropipetą). Dwa kolejne embriony zostały wykluczone z naszych danych, ponieważ zostały uszkodzone strukturalnie podczas aspiracji mikropipetą oraz z powodu pęknięcia ZP, co pozostawiło 89 ludzkich embrionów w naszym zestawie danych. Te 89 ludzkich embrionów zostało rozmrożonych i zmierzonych w mniejszych grupach w trakcie sześciu oddzielnych eksperymentów.
Hodowla ludzkich embrionów
Ludzkie embriony rozmrożono przy użyciu zestawu Quinn’s Advantage Thaw Kit (CooperSurgical), jak opisano wcześniej26,27. W skrócie, kriowialki lub słomki wyjmowano ze zbiornika z ciekłym azotem i wystawiano na działanie powietrza przed umieszczeniem ich w łaźni wodnej o temperaturze 37°C. Po rozmrożeniu, zarodki inkubowano w 0,5 i 0,2 M sacharozowym medium rozmrażającym w temperaturze 37°C przez 10 minut każdy. Następnie zarodki płukano w roztworze rozcieńczalnika rozmrażającego w temperaturze 37°C i hodowano przez 3-4 h w podłożu Quinn’s advantage cleavage medium (CooperSurgical) uzupełnionym 10% substytutem białka surowicy (CooperSurgical). W niektórych eksperymentach, zarodki były monitorowane pod kątem ich rozwoju przy użyciu systemu Eeva (Auxogyn).
Pobieranie zarodków i oocytów myszy oraz IVF
Myszy szczepu hybrydowego (C57B6xDBA2) F1 (4-6-tygodniowe samice) zostały zakupione od Jackson Laboratory i utrzymywane w ośrodku dla zwierząt w Lorry Lokey Stem Cell Research Building. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z protokołem Institutional Animal Care and Use Committee #16146, który został zatwierdzony przez Administrative Panel on Laboratory Animal Care na Uniwersytecie Stanforda. W skrócie, samice myszy były superowulowane przez dootrzewnowe wstrzyknięcie 10IU gonadotropiny surowicy ciężarnej klaczy (PMSG, Sigma) 10IU ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG, Sigma). Po kojarzeniu jednej samicy z 8-10-tygodniowym samcem tego samego szczepu, kompleksy cumulus-oocyt pobierano z jajowodów do podłoża M2 (Millipore), a komórki cumulusu usuwano w hialuronidazie (Sigma) i płukano w podłożu M2. Po pomiarach mechanicznych, zarodki hodowano w podłożu Quinn’s advantage cleavage medium (CooperSurgical) z 10% substytutem białka surowicy (CooperSurgical). Aby zmierzyć wpływ dojrzewania oocytów na mechanikę, oocyty pobierano w różnych stadiach dojrzewania. Oocyty GV pobierano 48 h po wstrzyknięciu PMSG. Około 48 h po wstrzyknięciu PMSG wstrzykiwano hCG. Oocyty MI zostały zebrane 5-6 h po wstrzyknięciu hCG, a oocyty MII zostały zebrane 18-20 h po wstrzyknięciu hCG.
Embryosy zostały wykluczone z naszych danych, jeśli wykazywały bardzo słabą morfologię, jeśli pochodziły od myszy, które wyprodukowały mniej niż 10 zarodków lub jeśli były w grupie, w której mniej niż 40% zarodków wykazało tworzenie pronukleusa po IVF. Jeśli myszy produkowały zbyt mało zarodków lub wskaźniki zapłodnienia były zbyt niskie, uznawaliśmy, że niektóre części protokołu eksperymentalnego (wstrzykiwanie hormonów, media, itd.) musiały mieć negatywny wpływ na zarodki i dlatego mogą one nie być reprezentatywne dla normalnych zarodków myszy. Aby posortować zarodki na grupy kontrolne i pomiarowe, zostały one losowo rozdzielone podczas oglądania pod wystarczająco małym powiększeniem, że morfologia była trudna do rozróżnienia. W każdym eksperymencie zachowano tylko kilka zarodków jako kontrole negatywne, w sumie 35 we wszystkich eksperymentach (Supplementary Fig. 5). Wielkości próbek dla eksperymentów na zwierzętach zostały określone częściowo przez ilość danych potrzebnych do osiągnięcia istotności statystycznej, a częściowo przez wielkości próbek zaobserwowanych w publikacjach z podobnymi badaniami. Dane mechaniczne i dotyczące tworzenia blastocyst dla 282 embrionów myszy, które zmierzyliśmy (Ryc. 4 i Ryc. 5) zostały zebrane w trakcie 15 oddzielnych eksperymentów.
Mikroiniekcja oocytów myszy i IVF
W tym eksperymencie użyto szczepu myszy CBA z Jackson Laboratory. Po indukowanej superowulacji u 4-6-tygodniowych samic myszy, pobierano oocyty zatrzymane w metafazie II i usuwano komórki cumulusowe. Następnie oocytom wstrzykiwano mikroiniekcję z ∼10 pl przeciwciała monoklonalnego 18A10 (abCam) w stężeniu 1 mg ml-1. Niektóre oocyty zachowano jako kontrolę negatywną i poddano albo pozorowanej iniekcji wody, albo nie wstrzyknięto ich wcale. Oocyty były następnie hodowane przez godzinę przed konwencjonalnym zabiegiem IVF. Plemniki pobierano od 8-10-tygodniowych samców CBA (Jackson Laboratory) i pozwalano im kapacytować w podłożu HTF (CooperSurgical) przez 45 min przed inseminacją. Odpowiednia ilość zawiesiny plemników była dodawana do kropli pożywki, w której hodowano oocyty. Żadna próbka nie została wykluczona z tego eksperymentu, a oocyty zostały posortowane na grupy kontrolne i mierzone, bez względu na morfologię i w przypadkowej kolejności.
Pomiar właściwości mechanicznych zarodków
Zautomatyzowany system aspiracji mikropipet został użyty do pomiaru zarodków, a zbudowany na zamówienie mikroskop świetlny został użyty do nagrywania wideo z aspiracji. Mikroskop został zbudowany z części pochodzących z Thorlabs i wykorzystuje obiektyw Olympus × 20, 0,4 apertury numerycznej oraz oświetlenie diodą emitującą białe światło. Aby przeprowadzić pomiar, każdy zarodek umieszczany jest w swojej własnej kropli pożywki, a mikropipeta opuszczana jest do kropli. Pipetą manipuluje się zarodkiem w taki sposób, aby ciało biegunowe było zwrócone w kierunku przeciwnym do otworu pipety. Brak kontroli pozycji pomiarowej może zmylić nasze wyniki, ponieważ w pobliżu ciała polarnego znajduje się przestrzeń pomiędzy oolemmą a ZP, podczas gdy ta przestrzeń perivitellina jest znacznie mniejsza wokół reszty zarodka. Badania wykazały również, że napięcie korowe oocytu jest spolaryzowane w stosunku do wrzeciona mejotycznego66; dlatego zadbaliśmy o to, aby zmierzyć koniec zarodka naprzeciwko ciała polarnego, który zwykle znajduje się blisko wrzeciona.
Mikropipety do pomiaru zarodków myszy miały średnicę wewnętrzną 40 μm (Origio MBB-FP-L-15); te dla zarodków ludzkich miały średnicę wewnętrzną 70 μ i były wykonane na zamówienie przez Origio. Stosuje się ciśnienie przytrzymujące -0,03 p.s.i. w celu przytrzymania zarodka i uszczelnienia otworu pipety. Następnie, do zarodka przykłada się ciśnienie skokowe -0,345 p.s.i. Pożądane ciśnienie jest stosowane przy użyciu zamkniętego systemu sterowania PID. Siłownik liniowy (Firgelli L12) porusza zatyczką strzykawki o pojemności 1 ml, a czujnik (Honeywell SSCSNBN010NDAA5) mierzy ciśnienie. Są one połączone z komputerem za pomocą mikrokontrolera Arduino Uno, który może przekazywać odczyty z czujników i wydawać polecenia siłownikowi w czasie rzeczywistym. Film z aspiracji jest nagrywany z prędkością 75 f.p.s. za pomocą kamery CMOS (Thorlabs DCC1545M). Wszystkie urządzenia są sterowane za pomocą specjalnie przygotowanego oprogramowania Labview (National Instruments). Zautomatyzowany program Matlab (Mathworks) został użyty do ekstrakcji głębokości aspiracji zarodka i dopasowania jej do modelu mechanicznego. Do identyfikacji narożnika i otworu pipety zastosowano detekcję krawędzi i progowanie Canny’ego. Do automatycznego śledzenia krawędzi zarodka w czasie zastosowano dopasowanie szablonów oparte na korelacji krzyżowej, co pozwoliło na wyeliminowanie błędów wynikających z pomiarów manualnych. Podczas pomiarów parametrów mechanicznych zarodków, badacz był zaślepiony na to, czy zarodki przeżyły do stadium blastocysty, czy też nie, lub do której grupy należały (w przypadku eksperymentów mikroiniekcji).
Mechaniczny model jednokomórkowych zarodków
Zmodyfikowany model bryły liniowo-sprężystej (zmodyfikowany model Zenera) został użyty do reprezentacji zarodka podczas aspiracji do mikropipety. Zakładając, że siła przyłożona do zarodka ma charakter krokowy, równanie głębokości aspiracji w czasie jest następujące:
Gdzie
Zmodyfikowany model Zenera został wybrany ponad inne powszechnie stosowane modele lepkosprężyste, takie jak Maxwella, Kelvina-Voigta i Zenera (Standard Linear Solid) w oparciu o wizualną inspekcję dynamiki odpowiedzi. W naszych eksperymentach zaobserwowaliśmy, że odpowiedź embrionu na skokowy nacisk była natychmiastowym wydłużeniem, po którym następował wykładniczy składnik zaniku (odwrócony tak, że odkształcenie wzrastało w czasie), a następnie odkształcenie ze stałą prędkością, jak pokazano na Rys. 2c.
Ciało Maxwella składa się ze sprężyny i dashpot’a połączonych szeregowo; dlatego jego odpowiedź na skokowy nacisk jest natychmiastowym wydłużeniem, po którym następuje stałe liniowe odkształcenie. Ponieważ nasze dane wykazywały wyraźną składową wykładniczą, model ten został uznany za niewystarczający do opisu naszego systemu. Ciało Kelvina-Voigta składa się z równolegle połączonych sprężyny i dashpot; dlatego jego odpowiedź na ciśnienie krokowe jest rozkładającą się wykładniczą, w której głębokość aspiracji osiąga ostateczną maksymalną głębokość. Model ten nie oddaje natychmiastowego wydłużenia zarodka, jak również liniowego tempa deformacji po ustabilizowaniu się składowej wykładniczej. Model Zenera dodaje dodatkową sprężynę równolegle do ciała Maxwella i jego odpowiedź na nacisk jest podobna do ciała Kelvina-Voigta, ale z natychmiastowym wydłużeniem, gdy nacisk jest zastosowany po raz pierwszy. Mimo to, model ten wymagał dodania dodatkowego dashpot’a w szeregu z pozostałymi trzema składowymi, aby dokładnie uchwycić liniową deformację doświadczaną przez zarodek po ustabilizowaniu się składowej wykładniczej.
Porównanie błędów dopasowania dla pięciu różnych modeli pokazano na Rys. 10. Nasz model (który ma 4 parametry) wydaje się odpowiedni, ponieważ jego błąd jest prawie tak niski jak błąd modelu pięcioparametrowego, z lub bez zbędnego dodatkowego parametru. Dlatego uważamy, że nasz model dokładnie opisuje dane bez nadmiernego dopasowania.
Ocena żywotności zarodków i parametrów cyklu komórkowego
Powstawanie blastocyst zostało użyte jako przybliżenie żywotności podczas konstruowania klasyfikatora do rozróżniania zarodków żywotnych i nieżywotnych na podstawie mechaniki. Klasyfikator ten został zwalidowany na myszach, jak pokazano na ryc. 2, w eksperymentach z żywymi narodzinami. Po zmierzeniu parametrów mechanicznych embrionów w dniu 1, embriony hodowano przez 5-6 dni w systemie Auxogyn Eeva, z klatkami rejestrowanymi co 5 minut. Parametry cyklu komórkowego27 zostały wyodrębnione z uzyskanych filmów, a zarodki tworzące blastocysty w 5 (mysz) lub 6 (człowiek) dniu zostały zakwalifikowane jako zdolne do życia.
Przewidywanie żywotności zarodków
Przeżywalność blastocyst została użyta jako informacja o prawdzie podstawowej do szkolenia klasyfikatora w celu przewidywania żywotności zarodków na podstawie pomiarów mechanicznych w 1 dniu. Binarny klasyfikator SVM z jądrem RBF został wytrenowany na parametrach mechanicznych zarodka. Optymalne wartości dla ograniczenia pudełkowego (c) i sigma RBF (σ) zostały wybrane przy użyciu 10-krotnej walidacji krzyżowej. Po określeniu optymalnych parametrów SVM, wykonano 100 symulacji Monte Carlo 10-krotnej walidacji krzyżowej w celu obliczenia średniego obszaru pod krzywą ROC i krzywą PR.
Ponieważ dla każdego zarodka zmierzono w sumie cztery parametry mechaniczne, przeprowadzono selekcję cech w celu określenia optymalnej liczby parametrów, które należy uwzględnić w naszym klasyfikatorze żywotności. Wyniki tego procesu pokazano na Rys. 2C, wykazując, że istnieje duża poprawa, gdy używa się dwóch parametrów zamiast jednego, i niewielka poprawa, gdy dodaje się trzeci parametr. Użycie wszystkich czterech parametrów zmniejsza skuteczność naszego klasyfikatora, ponieważ czwarty parametr nie jest użyteczny w oddzielaniu zarodków według żywotności, ale dodaje dodatkowy wymiar do danych.
Aby przeprowadzić selekcję cech, najpierw każdy parametr był używany samodzielnie do oddzielenia zarodków i znaleziono optymalny klasyfikator. Jak opisano powyżej, przeprowadzono 10-krotną walidację krzyżową, aby oszacować obszar pod krzywą ROC dla danego parametru. Po wybraniu parametru o najwyższej wartości predykcyjnej, nowy klasyfikator był trenowany i optymalizowany przy użyciu każdego z pozostałych parametrów. Parametr, który spowodował największą poprawę wartości predykcyjnej, był dodawany do klasyfikatora, a proces powtarzano do momentu, gdy nie pozostały żadne parametry.
W przypadku eksperymentów z uwalnianiem granulek korowych, dla uproszczenia, dane przedstawiono przy użyciu tylko parametru najbardziej predykcyjnego dla żywotności (sztywność, k1). Wcześniej wyszkolony trójparametrowy klasyfikator został użyty do posortowania zarodków według żywotności, ale ustaliliśmy, że liczby są najbardziej przejrzyste, gdy używamy tylko sztywności.
Doświadczenia z żywymi narodzinami u myszy
Samice myszyCD1 zostały zakupione z Jackson Laboratory i skojarzone z wazektomizowanymi samcami, aby służyły jako pseudopłodne biorczynie. Myszy utrzymywano w takich samych warunkach jak te używane do pobierania zarodków. Parametry mechaniczne zarodków pobranych od myszy (C57B6xDBA2) F1 były mierzone, a zarodki sortowano na podstawie tych parametrów do grup żywotnych lub nieżywotnych. W każdym eksperymencie równa liczba zarodków myszy w stadium jednokomórkowym (od 10 do 15) była przenoszona do jajowodów niedawno podłączonych biorczyń zarodków. Eksperyment ten powtarzano czterokrotnie (Tabela 1), przy czym w każdym eksperymencie do każdej myszy przenoszono 10-15 zarodków. Technik przenoszący zarodki był zaślepiony na to, które zarodki należały do której grupy. Ta sama liczba zarodków w tym samym stadium rozwoju była losowo wybierana i przenoszona do pseudopłodnych myszy jako kontrola. Szczeniąt spodziewano się w 20. dniu po zabiegu. Test χ2 został przeprowadzony w celu sprawdzenia, czy różnica w liczbie urodzonych szczeniąt w każdej grupie (żywotne, nieżywotne lub kontrolne) była statystycznie istotna.
Przygotowanie próbek RNA-seq
Dwa oddzielne eksperymenty zostały przeprowadzone z łącznie 32 ludzkimi zarodkami 2PN w celu uzyskania próbek do RNA-seq. Po rozmrożeniu zarodki miały 3-4 godziny na regenerację w podłożu hodowlanym, a następnie mierzono ich parametry mechaniczne. Każdy zarodek klasyfikowano jako żywotny lub nieżywotny na podstawie jego parametrów mechanicznych. cDNA z każdego zarodka syntetyzowano z całkowitego RNA przy użyciu zestawu SMARTer Ultra Low RNA (Clontech) zgodnie z protokołem dostawcy. Po ścinaniu pełnej długości cDNA metodą Covarisa, generowano ostateczne biblioteki przy użyciu zestawu NEBNext DNA Sample Prep Master Mix Set (New England Biolabs) i poddawano je kontroli jakości za pomocą bioanalizatora Agilent 2100. Uzyskane próbki poddano następnie sekwencjonowaniu RNA na platformie Illumina HiSeq 2000 przy użyciu strategii 100-bp paired-end.
Z 25 zarodków wybranych do sekwencjonowania, trzy zarodki zostały wykluczone z powodu trudności technicznych (nie odzyskano RNA). Do sekwencjonowania przekazaliśmy w sumie 22 zarodki, które zostały sklasyfikowane jako żywotne lub nieżywotne na podstawie parametrów mechanicznych.
Opracowanie danych RNA-seq
Sekwencjonowanie zwróciło ∼1 miliard sparowanych odczytów o długości 101, należących w sumie do 22 zarodków. Surowe dane sekwencji w formacie fastq zostały poddane kontroli jakości w celu usunięcia niskiej jakości wywołań bazowych i sekwencji adapterowych (FastX trimmer i clipper). Odfiltrowane sekwencje zostały następnie wyrównane do referencyjnego genomu ludzkiego (hg18) za pomocą narzędzia STAR aligner67 na komputerze. Uzyskane pliki .bam były filtrowane pod kątem jakości wyrównania, sortowane i usuwano z nich duplikaty PCR (SAMtools sort i rmdup). Następnie obliczono liczbę genów przy użyciu HTSeq-count68 i porównano wyrównane odczyty z referencyjnym transkryptomem ludzkim.
Aby uwzględnić możliwe efekty partii wynikające z biologicznych różnic między pacjentami, różnych protokołów mrożenia, mediów hodowlanych lub innych czynników, musieliśmy określić, które zarodki pochodzą od których pacjentów. Przeanalizowaliśmy warianty sekwencji w transkryptomie każdego zarodka i przeprowadziliśmy hierarchiczne grupowanie wariantów, dla których mieliśmy dobre pokrycie sekwencjonowania (Supplementary Fig. 11). Ustaliliśmy, że spośród 22 zarodków poddanych sekwencjonowaniu, 17 miało zarodki „rodzeństwa”, podczas gdy 5 było jedynymi zarodkami pochodzącymi od odpowiednich pacjentów. Wykluczyliśmy tych pięciu, a następnie użyliśmy funkcji ComBat w pakiecie sva69,70 w R do usunięcia efektów partii z danych RNA-seq z pozostałych 17 zarodków. Chociaż wykluczenie pięciu zarodków bez rodzeństwa mogło wpłynąć na nasze wyniki, niemożliwe byłoby oszacowanie zmienności biologicznej w obrębie tych pacjentów przy użyciu tylko jednej próbki, dlatego musieliśmy je wykluczyć. Po usunięciu tych efektów partii, nasze dane odzwierciedlały różnice w transkryptach dziedziczonych matczynie pomiędzy zarodkami zdolnymi do życia i niezdolnymi do życia, spójne dla wszystkich pacjentów. Analiza ekspresji różnicowej została przeprowadzona na skorygowanych danych przy użyciu pakietu R edgeR28. Geny z wartościami q (wartości P skorygowane metodą Benjamini-Hochberg) mniejszymi niż 0,01 zostały zaklasyfikowane jako statystycznie istotne.
Analiza ontologiczna i sieciowa genów
Lista genów DE z wartościami q<0,01 została przekazana do narzędzia DAVID (NCBI), a następnie przeprowadzono klasteryzację za pomocą terminów ontologicznych związanych z BP i funkcjami molekularnymi (MF). Klastry z przynajmniej jednym terminem o skorygowanej wartości P<0,05 uznano za istotne statystycznie i umieszczono w tabeli 1. Terminy w obrębie każdego klastra zostały połączone w jedno wyrażenie opisowe i włączone do Tabeli 1. Dalsza analiza ontologii genów została przeprowadzona przy użyciu pakietów goseq i GO.db w R. Wszystkie kategorie ontologii genów z co najmniej 10 genami zostały uszeregowane w kolejności procentowej genów DE w ramach danej kategorii i porównane z proporcją genów DE we wszystkich kategoriach.
IPA została użyta do analizy listy genów DE wraz ze zmianą log-fold pomiędzy zarodkami zdolnymi i niezdolnymi do życia. Przeprowadzono analizę rdzeniową w celu znalezienia procesów komórkowych, które były przewidywane jako znacząco zwiększone lub zmniejszone na podstawie zmian ekspresji genów, jak również sieci genów, które były regulowane jako grupa.
Barwienie ziarnistości korowych
Parametry mechaniczne zarodków myszy B6 i zarodków z IVF (od myszy CBA) były mierzone na etapie zygoty w dwóch oddzielnych eksperymentach. Zarodki klasyfikowano jako żywotne lub nieżywotne na podstawie ich parametrów mechanicznych, a następnie usuwano ZP poprzez krótką ekspozycję zarodków na roztwór Tyrode’a (Sigma), po której następowały trzykrotne płukania w PBS (Invitrogen). Zdemodulowane zarodki utrwalano następnie w 4% paraformaldehydzie przez 20 min w temperaturze pokojowej i barwiono przeciwciałem przeciw lektynie znakowanym izotiocyjanianem fluoresceiny (Sigma) i 4,6-diamidino-2-fenyloindolem. Laserowo skanujący mikroskop konfokalny Zeiss LSM510 został użyty do wizualizacji i przechwytywania obrazów.
Obróbka obrazów konfokalnych
Szczątkowe stosy obrazów zostały przekonwertowane do formatu TIFF i niestandardowe skrypty Matlab zostały napisane w celu wyodrębnienia parametrów obrazu. Dostosowanie kontrastu przeprowadzono na wszystkich obrazach w każdym stosie, aby uwzględnić utratę sygnału przy większych głębokościach obrazowania, a obraz projekcji został obliczony dla każdego stosu. Cytoplazma każdej komórki została wyizolowana poprzez automatyczne progowanie metodą Otsu, detekcję krawędzi Canny’ego i kołową transformatę Hougha w celu wykrycia położenia i rozmiaru każdej komórki. Obliczono profil intensywności wzdłuż ścieżki wokół obwodu każdej komórki, na 95% promienia komórki i o szerokości 10% promienia komórki. Parametry wykreślone na obrazie 4 to (a) średnia i (b) odchylenie standardowe tego profilu intensywności. Badacz był zaślepiony na parametry mechaniczne każdego zarodka i grupę (w przypadku eksperymentów z mikroiniekcją) podczas pomiaru parametrów ziarnistości korowych.
Testy statystyczne
Test χ2 został użyty do sprawdzenia, czy proporcja zarodków skutkujących żywym urodzeniem (sekcja 2.2) różniła się istotnie pomiędzy trzema grupami eksperymentalnymi (przewidywaną żywotnością opartą na mechanice, przewidywaną nieżywotnością opartą na mechanice i kontrolą – posortowaną tylko według morfologii). Jedynym założeniem tego testu jest to, że żadna grupa („grupa” odnosi się zarówno do zarodków, których wynikiem jest urodzenie żywego dziecka, jak i zarodków, których wynikiem nie jest urodzenie żywego dziecka) nie zawiera mniej niż pięć próbek. Założenie to jest spełnione dla obu porównań, które zostały wykonane (żywotne vs. kontrolne, żywotne vs. nieżywotne).
Aby określić geny z istotnymi różnicami w ekspresji pomiędzy żywotnymi i nieżywotnymi zarodkami ludzkimi, użyto pakietów sva i edgeR w R. Pakiety te zostały dobrze zwalidowane. Pakiety te zostały dobrze zwalidowane do użycia w usuwaniu efektów partii i określaniu znaczących różnic w ekspresji dla danych RNA-seq.
Test sumy rang Wilcoxona został użyty do porównania jasności ziarnistości korowych między zarodkami (test t nie został użyty, ponieważ próbki miały niską liczbę i nie były normalnie rozłożone zgodnie z testem Lillieforsa). Aby określić, czy wstrzyknięcie przeciwciała IP3 zmieniło średnią sztywność zarodka, użyto dwustronnego testu t, ponieważ grupy wstrzykiwane przeciwciałem i kontrolne zostały uznane za normalnie rozłożone przy użyciu testu Lillieforsa. Dwusample’owego testu Kołmogorowa-Smirnowa użyto, aby wykazać, że wstrzyknięcie przeciwciała spowodowało znaczącą zmianę w rozkładzie wartości sztywności. Testy sumy rang Wilcoxona zostały użyte do porównania różnic między kwartylami grup wstrzykiwanych przeciwciał i kontrolnych, ponieważ w każdym kwartylu było bardzo mało próbek. Testy sumy rang Wilcoxona zostały również użyte do zbadania różnicy w wartościach mediany sztywności oocytów pomiędzy stadiami GV, MI i MII, ponieważ wartości sztywności nie spełniały kryteriów normalności.
.