OBSERWACJA
Kształty komórek bakterii reprezentują miliardy lat ewolucyjnego doskonalenia. Ich mały rozmiar skutkuje wysokim stosunkiem powierzchni do objętości, który jest idealny do transportu składników odżywczych, wydajnego oddychania i utrzymania integralności strukturalnej. Wiadomo, że ogólny kształt komórki jest regulowany przez wiele procesów komórkowych i czynników środowiskowych (1-3). Szybko jednak staje się wyzwaniem wskazanie, w jaki sposób różnice w kształcie wpływają na funkcjonowanie komórki. Dane w skali genomu opisujące genetyczny wkład w morfologię bakterii są krokiem w kierunku odpowiedzi na to pytanie. Co więcej, powstałe sieci interakcji reprezentują wiele powiązanych ze sobą sieci biologicznych wynikających z różnych fenotypów kształtu. W tym miejscu opisujemy genomową migawkę morfologii Escherichia coli K-12 w środkowej fazie wykładniczej przy użyciu kolekcji delecji Keio (4). Dalej charakteryzujemy interakcje genetyczne pomiędzy delecjami wpływającymi na kształt a genomem E. coli przy użyciu koniugacji o wysokiej wydajności (5, 6).
Opracowana przez nas platforma obrazowania o wysokiej zawartości jest wysoce dostosowana do skomplikowanego zadania obrazowania bakterii. Czas obrazowania dla płytek mikrostudzienkowych o dużej gęstości (384- lub 1536-studzienek) może znacznie przekroczyć około 20-minutowy czas podwojenia dla E. coli, co stanowi czasowe wyzwanie dla obrazowania bibliotek genomowych we wspólnej fazie wzrostu. Ponadto, ruchliwość żywych komórek bakteryjnych stwarza dodatkowe trudności w ograniczaniu mobilności komórek podczas obrazowania mikroskopowego. Przeciwstawiliśmy się tym wyzwaniom stosując utrwalacz glutaraldehydowy; powszechny pierwszy krok w preparatach mikroskopii elektronowej i znany z tego, że zachowuje kształt komórek z pomijalnym wpływem na rozdzielczość mikroskopii świetlnej (7). Komórki zostały następnie negatywnie wybarwione w płytkach obrazowych z dnem szklanym (grubość 0,17 mm) przy użyciu nigrozyny i delikatnie utrwalone termicznie z kontrolą wilgotności, doprowadzając wszystkie komórki do wspólnej płaszczyzny ogniskowej. Uniknięto w ten sposób konieczności stosowania kontrastu fazowego, który był niewykonalny ze względu na to, że stożek światła z pierścienia fazowego był blokowany przez krawędzie studzienek w mikropłytkach 384-dołkowych i o większej gęstości. Zastosowanie jasnego pola pozwoliło na przepuszczenie większej ilości światła przez próbkę, co skutkowało szybszą ekspozycją i lepszą dokładnością ogniskowej. Tak przygotowane płytki można ponownie naświetlać bez końca, a jakość obrazu nie pogarsza się z czasem, co ułatwia obrazowanie próbek o dużej zawartości, które zostały utrwalone w określonej fazie wzrostu. Uzyskane obrazy wykazują intensywny kontrast między komórkami a tłem, co jest wysoce pożądane w obrazowaniu ilościowym (ryc. 1; w pełni szczegółowo opisane w Tekście S1 i ryc. S1 w materiale dodatkowym). Dziesięć cech morfologicznych było kwantyfikowanych dla każdego nokautu: obszar, obwód, minimalna oś elipsy, minimalna długość Fereta, główna oś elipsy, główna długość Fereta, okrągłość, okrągłość, proporcje i solidność. Następnie wykorzystaliśmy analizę głównych składowych (PCA) jako analizę wieloparametryczną i środek redukcji wymiarowości (Ryc. 1; Ryc. S1). Dało nam to całkowicie bezstronne środki sortowania fenotypowego po akwizycji. Nienormalnie ukształtowane zabiegi zostały ujawnione przez dopasowanie elipsoidy wokół klastra danych reprezentujących morfologię typu dzikiego w przestrzeni głównych składowych i wybranie tych, które wypadły poza tę strefę odcięcia. Granice x, y, i z elipsoidy w każdym wymiarze odpowiadają odcięciu 3 odchyleń standardowych w pierwszych trzech składowych głównych.
TEKST S1
Copyright © 2017 French et al.
Ta treść jest rozpowszechniana zgodnie z warunkami licencji Creative Commons Attribution 4.0 International.
FIG S1
Copyright © 2017 French et al.
Ta treść jest rozpowszechniana zgodnie z warunkami licencji Creative Commons Attribution 4.0 International.
Wysokowydajny screen kształtu komórek z kolekcji E. coli nonessential gene deletion (Keio). Przedstawione mikrografy zostały uzyskane w modyfikacji high-throughput metod mikroskopowych opisanych przez Czarny et al. (25). Górne panele przedstawiają przykładowe fenotypy morfologiczne zaobserwowane w genach z kolekcji Keio: komórki E. coli K-12 BW25113 typu dzikiego, komórki ΔtatA długie i połączone łańcuchami, komórki ΔholD bardzo długie, komórki ΔpdxH długie i sporadycznie połączone łańcuchami, komórki ΔrodZ okrągłe oraz komórki ΔenvC długie. Zestaw danych z adnotacjami znajduje się w Tabeli S1, gdzie poszczególne trafienia genów mogą być lepiej zwizualizowane. Wykres słupkowy przedstawia analizę głównych składowych cech z analizy obrazu i ujawnia, że większość wariancji jest wyjaśniona przez trzy główne składowe. Po wykreśleniu w trzech wymiarach, te główne składowe mogą być dopasowane do elipsoidy otaczającej początek, który opisuje zmienność morfologii komórek. Elipsoida jest ograniczona przez odległości od początku, które wynoszą 3 odchylenia standardowe w każdym wymiarze składowej głównej, odpowiednio, od początku opisującego komórki typu dzikiego. Mutacje zaburzające kształt są tutaj zdefiniowane jako posiadające współrzędne składowej głównej poza elipsoidą.
W ten sposób zidentyfikowaliśmy około 111 mutacji delecyjnych z defektami kształtu (patrz Tabela S1 i Zestaw danych S1 w materiale dodatkowym). Nasze podejście zostało zatwierdzone z potwierdzeniem kilku znanych mutantów kształtowych, w tym mutanta delecyjnego tatA, wcześniej wykazanego jako długi i łańcuchowy z powodu niewłaściwej lokalizacji amidaz w peryplazmie (8). Wiadomo, że mutacje w holD, kodujące podjednostkę ψ polimerazy DNA, powodują filamentowe morfologie u E. coli (9). Rzeczywiście, replikacja DNA ma synchroniczny związek z procesami podziału komórek (10, 11), przy czym zaburzenia w gyrazie DNA skutkują wydłużonymi komórkami z pojedynczymi chromosomami i brakiem przegród (12). Co ciekawe, oksydaza 5′-fosforanu pirydoksyny, kodowana przez pdxH, generuje 5′-fosforan pirydoksalu (PLP) i spowodowała przesunięcie w kierunku długich, sporadycznie połączonych łańcuchami komórek. PLP jest kluczowym kofaktorem w dostarczaniu d-alaniny i d-glutaminianu do syntezy peptydoglikanu ściany komórkowej (13), a mutanty pdxH znane są z fenotypu filamentowego (14). Podobnie, EnvC jest aktywatorem enzymów przebudowujących ścianę komórkową i wiadomo, że powoduje wzrost nitkowaty (15), a RodZ jest zaangażowany w tworzenie ścian bocznych i wiadomo, że powoduje morfologię kulistą (16). Wszystkie te fenotypy zostały potwierdzone w naszym badaniu. Zaskakująco, 52 geny z naszej listy kodują białka niescharakteryzowane u E. coli, przy czym wiele z nich to przypuszczalne białka błony zewnętrznej lub cytoplazmatycznej (Tabela S1). Tak więc, opisana platforma przesiewowa o wysokiej zawartości zidentyfikowała nieistotne geny zaangażowane w utrzymanie kształtu. Aby dokładniej scharakteryzować i zbadać procesy biologiczne oddziałujące z tymi mutacjami, zdecydowaliśmy się na przygotowanie tablicy interakcji genetycznych, skupiając się na tych genach kształtu.
TABELA S1
Copyright © 2017 French et al.
Ta treść jest rozpowszechniana zgodnie z warunkami licencji Creative Commons Attribution 4.0 International.
ZESTAW DANYCH S1
Copyright © 2017 French i wsp.
Ta treść jest rozpowszechniana na warunkach licencji Creative Commons Attribution 4.0 International.
W sumie 60 delecji odpowiadających najsilniejszym defektom kształtu zostało wybranych jako geny zapytań w syntetycznej tablicy genetycznej, z których 7 nie sprzęgło się dobrze przy użyciu metodologii Côté i wsp. (17). W ten sposób 53 interesujące nas geny kształtu z Tabeli S1 zostały systematycznie skrzyżowane (5, 6) z kolekcją Keio, generując 1,7 × 107 mutantów z podwójną delecją (patrz Zestaw Danych S2 w materiale dodatkowym) i syntetyczną sieć interakcji letalnych (patrz Rys. S3 w materiale dodatkowym). Zauważyliśmy, że mutanty z bardziej ekstremalnymi zmianami kształtu (na przykład mutanty pdxH, rodZ, envC i gpmM) nie kojarzyły się prawidłowo w konwencjonalnych warunkach i wymagały kojarzenia w temperaturze pokojowej przez dłuższy czas. Gdy geny leżące u podstaw syntetycznych interakcji letalnych zostały wzbogacone przy użyciu terminów Gene Ontology (GO) dla procesów biologicznych, procesy transportu i utleniania-redukcji były nadreprezentowane (Ryc. 2; Ryc. S3). Zostało to oparte na histogramie częstości występowania dla każdego terminu GO, z ontologiami dostępnymi przy użyciu oprogramowania EcoCyc (18) pathway-tools (19). Co ciekawe, kanał błony zewnętrznej TolC jest obecny z wysoką częstotliwością, co sugeruje związek między efektywnością systemu effluxu leków (Acr, Mdt, Ent, Emr i Mac) a kształtem komórki. Przewidywany symporter YdjN, który występuje najczęściej, jest ponadto zaangażowany w transport l-cysteiny i odpowiedź na stres oksydacyjny (20), procesy biologiczne przypadkowo wzbogacone na Rys. 2. Istotnie, geny zaangażowane w procesy redoks były często związane z oddychaniem, tak jak w przypadku ytfG, napG, cydB, nrdD i nrdG. Jest to szczególnie interesujące, biorąc pod uwagę, że kształt/kurkatura błony odgrywa rolę w funkcji białek związanych z błoną (21, 22), zwłaszcza biorąc pod uwagę potencjalne związki między skutecznością leków a oddychaniem komórkowym (23, 24). Jednakże, zrozumienie związku pomiędzy kształtem (lub powierzchnią) komórki a oddychaniem jest ograniczone. Zaobserwowaliśmy niezwykłą przewagę interakcji genów kształtu z genami zaangażowanymi w funkcje oddechowe. Na przykład, w pracy Côté i wsp. (17), 82 geny stresu pokarmowego zostały skrzyżowane z kolekcją Keio i zaowocowało to mniej niż 200 syntetycznymi interakcjami letalnymi z genami zaangażowanymi w procesy redoks, podczas gdy dla kontrastu, około 800 takich interakcji zaobserwowano dla 53 genów zaburzających kształt (Ryc. 2).
DATA SET S2
Copyright © 2017 French et al.
Ta treść jest rozpowszechniana zgodnie z warunkami licencji Creative Commons Attribution 4.0 International.
FIG S2
Copyright © 2017 French et al.
Ta treść jest rozpowszechniana zgodnie z warunkami licencji Creative Commons Attribution 4.0 International.
FIG S3
Copyright © 2017 French et al.
Ta treść jest rozpowszechniana zgodnie z warunkami licencji Creative Commons Attribution 4.0 International.
Analiza w skali genomu genów E. coli, które wchodzą w interakcje z genami zaburzającymi kształt. Lewy panel pokazuje mapę ciepła dla interakcji syntetycznie letalnych i histogram częstości występowania dla procesów biologicznych, uporządkowanych według terminów GO. Syntetyczne interakcje letalne zostały zidentyfikowane przy użyciu metody Côté i wsp. (17), z adnotacjami zidentyfikowanymi przy użyciu oprogramowania EcoCyc pathway-tools (19). (Terminy GO zostały wygenerowane na podstawie naszych 1373 genów syntetycznej letalności, przy czym wiele genów posiada wiele odpowiadających im terminów procesów biologicznych). Procesy transportowe, redoks i metaboliczne wykazywały silne wzbogacenie i są zaznaczone czerwonymi gwiazdkami. Każdy z tych procesów został dokładniej omówiony w panelach po prawej stronie, gdzie podkreślono najczęściej występujące interakcje syntetycznej śmierci i odpowiadające im produkty genowe. Co ciekawe, wiele genów transportowych jest ściśle związanych z oddychaniem i symportacją protonów, takich jak cydD, putP i trkG. Ogólnie rzecz biorąc, pokazuje to skomplikowany związek między kształtem komórki, transportem i procesami utleniania-redukcji w E. coli.
Przebadanie kolekcji Keio pod kątem delecji genów skutkujących defektami kształtu nieoczekiwanie przyniosło bogactwo niezbadanych genów. Powiązanie tych genów z rolami w kształcie komórki może pomóc w dalszej klasyfikacji funkcjonalnej, zwłaszcza gdy jednocześnie profiluje się ich interakcje genetyczne. Ogólnie rzecz biorąc, geny zaangażowane w utrzymanie kształtu wydają się być nieodłącznie związane z procesami biologicznymi, takimi jak transport, utlenianie i redukcja, ale konieczne są dalsze prace, aby wyjaśnić naturę obserwowanych interakcji. Szczególnie interesujące jest to, czy defektom kształtu towarzyszą fizyczne perturbacje, takie jak geometria upakowania lub zmiany krzywizny (21). Niemniej jednak, przedstawione tutaj badania poszerzają nasze zrozumienie skomplikowanej biologii, która definiuje kształt bakterii. Co więcej, opisana tu platforma mikroskopii o wysokiej zawartości jest wysoce podatna na zmiany w każdej bakteryjnej bibliotece genomowej lub chemicznej.