William Howell Masters werd op 27 december 1915 in Cleveland, Ohio, geboren als zoon van Francis Wynne en Estabrooks (Taylor) Masters. Hij bezocht de openbare school in Kansas City tot en met de achtste klas en ging daarna naar de Lawrenceville School in Lawrenceville, New Jersey. In 1938 behaalde hij zijn B.S. aan het Hamilton College, waar hij zijn tijd verdeelde tussen exacte vakken en sporten als honkbal, voetbal en basketbal. Hij was ook actief in het debat op de campus. Hij ging naar de University of Rochester School of Medicine en ging werken in het laboratorium van Dr. George Corner, die de voortplantingsorganen van dieren en mensen vergeleek en bestudeerde.
Tijdens zijn eerste jaar op de medische faculteit raakte Masters geïnteresseerd in seksualiteit, omdat het de laatste wetenschappelijk onontgonnen fysiologische functie was. Na korte tijd in de marine te hebben gediend, behaalde hij zijn M.D. in 1943. Masters raakte geïnteresseerd in het werk van Dr. Alfred Kinsey, een professor in de dierkunde aan de Universiteit van Indiana, die duizenden mannen en vrouwen had geïnterviewd over hun seksuele ervaringen. Hij koos een vakgebied dat hem zou helpen zich voor te bereiden op het onderzoek naar de menselijke seksualiteit en werd stagiair en later resident in de verloskunde en gynaecologie in het St. Louis Hospital en het Barnes Hospital in St. Louis. Hij deed ook een stage in de pathologie aan de Washington University School of Medicine. In 1947 trad hij toe tot de faculteit van Washington en klom op van instructeur tot universitair hoofddocent klinische verloskunde en gynaecologie. Masters deed onderzoek op dit gebied en schreef tientallen artikelen in wetenschappelijke tijdschriften. Een van zijn aandachtsgebieden was hormoonbehandeling en -vervanging bij postmenopauzale vrouwen.
In 1954 besloot Masters dat hij klaar was om onderzoek te gaan doen naar de fysiologie van seks. Hij was bezorgd dat de medische wereld te weinig informatie had over seksualiteit om de problemen van cliënten te begrijpen. Kinsey was afhankelijk geweest van casuïstiek, interviews en tweedehands gegevens. Masters nam de volgende stap, namelijk het bestuderen van menselijke seksuele stimulatie met behulp van meettechnologie in een laboratoriumsituatie.
Masters startte zijn project aan de Washington University, geholpen door een beurs van het United States Institute of Health. Aanvankelijk wierf hij prostituees aan voor onderzoek, maar hij vond hen ongeschikt voor zijn studies van “normale” seksualiteit. In 1956 nam hij Virginia Eshelman Johnson, een studente sociologie, in dienst om te helpen bij het interviewen en screenen van vrijwilligers. De studie werd uitgevoerd over een periode van elf jaar met 382 deelnemende vrouwen en 312 deelnemende mannen. De deelnemers varieerden in leeftijd van achttien tot negenentachtig jaar en werden betaald voor hun tijd. Masters vond een cyclus van vier fasen in de seksuele reacties van mannen en vrouwen. Om de fysiologische veranderingen te meten gebruikte hij elektro-encefalografen, elektrocardiografen, kleurencinematografie en biochemische studies.
Masters was zeer voorzichtig en nauwgezet in het beschermen van de identiteit van zijn vrijwilligers. In 1959 stuurde hij enkele resultaten naar medische tijdschriften, maar hij bleef in het betrekkelijke geheim werken. Nadat de inhoud van de studies was uitgelekt, had het team moeite om aan subsidies te komen, zodat Masters in 1964 directeur werd van de Reproductive Biology Foundation, een non-profit groep, om particuliere fondsen te werven. In november van datzelfde jaar schreef Dr. Leslie H. Farber, een gerespecteerd psychiater uit Washington D.C., een artikel in Commentary getiteld “I’m sorry, Dear,” waarin hij de “verwetenschappelijking” van seks aanviel. Deze aanval was slechts het begin van de kritiek die het onderzoek zou krijgen.
In 1966 publiceerden Masters en Johnson Human Sexual Response. In dit boek gebruikten de onderzoekers zeer technische terminologie en lieten ze hun uitgever, Little, Brown and Co., het boek alleen promoten bij medische professionals en in tijdschriften. Niettemin werd het boek een populaire sensatie en het team begon aan een spreekbeurt- en lezingentournee, waarmee het onmiddellijk bekendheid verwierf. Al in 1959 waren Masters en Johnson begonnen met het adviseren van paren als een team van twee seksen. In de overtuiging dat partners zich meer op hun gemak zouden voelen om met een therapeut van hetzelfde geslacht te praten, begon het team te werken aan de seksuele problemen van paren. In hun tweede boek, Human Sexual Inadequacy (1970), bespreken zij problemen zoals impotentie.
Masters scheidde van zijn eerste vrouw, Elisabeth Ellis, niet lang na de publicatie van Human Sexual Inadequacy en trouwde met Johnson op 1 januari 1971 in Fayetteville, Arkansas. In 1973 werden zij mededirecteuren van het Masters and Johnson Institute. In 1979 bestudeerden en beschreven Masters en Johnson de seksuele reacties van homoseksuelen en lesbiennes in Homosexuality in Perspective. Zij beweerden ook in staat te zijn de seksuele voorkeur van homoseksuelen die dat wilden te veranderen. Masters had ook een biochemisch laboratorium en bleef honoraria ontvangen van een gynaecologiepraktijk. Hij ging in 1975 op zestigjarige leeftijd met pensioen. In 1981 verkochten Masters en Johnson hun laboratorium en verhuisden naar een andere locatie in St. Louis. In die tijd hadden zij een staf van vijfentwintig mensen en een lange lijst van cliënten.
Er ontstond nog meer controverse over hun werk toen Masters en Johnson in 1988 een boek schreven samen met een medewerker, Dr. Robert Kolodny. Het boek, Crisis: Heterosexual Behavior in the Age of AIDS, voorspelde een epidemie van AIDS onder de heteroseksuele bevolking. Sommige leden van de medische gemeenschap veroordeelden de studie scherp, en C. Everett Koop, toenmalig chirurg-generaal van de Verenigde Staten, noemde Masters en Johnson onverantwoordelijk. Misschien als gevolg van de negatieve publiciteit daalde het aantal cliënten dat sekstherapie zocht in het instituut. Begin 1992 kondigde Bill Walters, waarnemend directeur van het instituut, aan dat Masters en Johnson na 21 jaar huwelijk zouden gaan scheiden. Masters zwoer dat hij nooit met pensioen zou gaan en bleef spreken en lezingen geven aan het instituut, naast het werken aan een ander boek. De scheiding maakte een einde aan hun samenwerking in de kliniek.
Voor zijn baanbrekende inspanningen om van de menselijke seksualiteit een onderwerp van wetenschappelijke studie te maken, ontving Masters de Paul H. Hoch Award van de American Psychopathic Association in 1971, de Sex Information and Education Council of the United States (SIECUS) award in 1972, en drie andere prestigieuze onderscheidingen. Hij is lid van de American Association for the Advancement of Science (AAAS), de American Fertility Society, en verschillende andere medische verenigingen.