Van 1853 tot 1860 was Billroth assistent in de chirurgische kliniek van Bernhard von Langenbeck aan de Charité in Berlijn. Daar was hij ook in de leer bij Carl Langenbuch. In 1860 aanvaardde Billroth een aanbod van de universiteit van Zürich om leerstoel klinische chirurgie te worden en werd hij directeur van het chirurgisch ziekenhuis en de kliniek in Zürich. Het begin van zijn carrière in Zwitserland was niet veelbelovend: tijdens zijn eerste semester lesgeven had hij slechts tien studenten, en hij zei zelf dat de inkomsten die hij uit zijn privépraktijk ontving onvoldoende waren om zijn ochtendkoffie te betalen. Zijn reputatie groeide echter snel; Billroth had een aanstekelijke persoonlijkheid, die zowel studenten als chirurgische stagiaires in zijn gelederen aantrok. Hij was geliefd bij zijn studenten, en was een effectieve docent, zowel voor studenten als voor afgestudeerden. Studenten stroomden toe naar zijn colleges, en met de medewerking van energieke collega’s was hij in staat de Medische Faculteit van Zürich in slechts enkele jaren op te stuwen naar een vooraanstaande positie onder de Duitstalige scholen.
Tijdens zijn verblijf in Zürich publiceerde Billroth zijn klassieke leerboek Die allgemeine chirurgische Pathologie und Therapie (Algemene chirurgische pathologie en therapie) (1863). Tegelijkertijd introduceerde hij het concept van audits, waarbij alle resultaten, goed en slecht, werden gepubliceerd, wat automatisch leidde tot een eerlijke discussie over morbiditeit, mortaliteit en technieken – met als gevolg verbeteringen in de selectie van patiënten.
Hij werd in 1867 benoemd tot hoogleraar chirurgie aan de Universiteit van Wenen, als opvolger van Franz Schuh; daar beoefende hij de chirurgie als chef van de Tweede Chirurgische Kliniek in het Allgemeine Krankenhaus (Algemeen Ziekenhuis Wenen). Hoewel hij de basis van zijn roem in Zürich legde, was het in Wenen, een groter en opvallender theater, dat hij zich vestigde als de macht die hij in de chirurgische wereld was. Een toespraak die hij in 1875 hield, waarin hij protesteerde tegen de instroom van Joodse medische studenten, wordt beschouwd als een van de eerste gebeurtenissen in de ontwikkeling van het Weense politieke antisemitisme.
Tijdens de Frans-Pruisische oorlog deed Billroth uitstekend werk in het militaire hospitaal van Mannheim en Weissenburg, waar hij een verscheidenheid aan gruwelijke verwondingen op het slagveld behandelde met agressieve en ambitieuze operaties; zijn ervaringen met de oorlogschirurgie legde hij vast in zijn Surgical Letters from Mannheim and Weissenburg. Hij was zo onder de indruk van de gruwelen van de oorlog dat hij daarna altijd een vurig voorstander van de vrede is gebleven. Op 3 december 1891 hield hij een rede over de verzorging van gewonden in de oorlog, die grote opschudding veroorzaakte en ertoe leidde dat de Oostenrijkse wetgevende kamers grote sommen geld goedkeurden voor de verstrekking van adequate middelen van hulp aan de gewonden.
Hij beperkte zich niet tot de chirurgie alleen en deed uitgebreid onderzoek naar een kwaal die in die tijd veel operatiepatiënten trof: wondkoorts. Zijn verhandeling over wondkoorts, Untersuchungen über die Vegetationsformen von Coccobacteria septica (1874; “Onderzoek naar de vegetale vormen van Coccobacteria septica”) concludeerde dat de oorzaak bacterieel was; Billroth paste al snel antiseptische technieken toe in zijn chirurgische praktijk en het aantal chirurgische patiënten dat werd getroffen door wondkoorts nam sterk af. Met de dreiging van fatale chirurgische infecties verminderd door zijn werk en dat van anderen, richtte Billroth zijn aandacht op de chirurgie en het baanbrekende gebied van het veranderen of verwijderen van organen die voorheen als ontoegankelijk werden beschouwd.
Een vroege aanhanger van de “witte jas” (zoals te zien op het schilderij van Seligmann van ca. 1890 In 1872 voerde hij als eerste een slokdarmoperatie uit, waarbij een deel van de slokdarm werd verwijderd en de resterende delen met elkaar werden verbonden. In 1873 voerde hij de eerste laryngectomie uit, waarbij een kankergezwel in het strottenhoofd volledig werd weggesneden. Hij was de eerste chirurg die endeldarmkanker verwijderde en in 1876 had hij 33 van dergelijke operaties uitgevoerd. In 1881 had Billroth de darmchirurgie bijna alledaags doen lijken. Maar zijn beroemdste prestatie is ongetwijfeld de eerste succesvolle gastrectomie bij maagkanker. Op 29 januari 1881 voerde Billroth, na vele noodlottige pogingen, de eerste succesvolle resectie van antraliskanker uit bij Therese Heller, die bijna 4 maanden leefde en daarna stierf aan levermetastasen. Hij voltooide deze operatie door de grotere kromming van de maag te sluiten en de kleinere kromming naar de twaalfvingerige darm te anatomiseren, in een operatie die tot op de dag van vandaag bekend staat als de Billroth I.
Billroth’s literaire activiteit was wijd verbreid, het totale aantal gepubliceerde boeken en artikelen waarvan hij de auteur was, bedroeg ongeveer honderdveertig. Hij werkte samen met Franz von Pitha aan een Textbook of General and Special Surgery (1882). Billroth droeg bij aan het hoofdstuk over scrofulose en tuberculose, verwondingen en ziekten van de borst, instrumenten en operaties, brandwonden, bevriezing, enz.
Billroth gaf zijn rusteloze intellectuele geest door aan talrijke vooraanstaande studenten, waardoor de “Billroth School” van volgelingen ontstond. Geen aspect van zijn beroep leek te ontsnappen aan zijn intens onderzoek, of het nu ging om onderzoek, onderwijs, administratie, of verpleging. Hij had niet alleen iets waardevols te zeggen over elk, maar zorgde er ook vaak voor dat zijn ideeën concrete werkelijkheid werden. Op alle gebieden waarop hij invloed trachtte uit te oefenen, werd hij geleid door een geloof in de eenheid van wetenschap en kunst, en door vertrouwen in zijn eigen vermogen om veranderingen teweeg te brengen.
Billroth was behulpzaam bij het oprichten van de eerste moderne school van denken in de chirurgie. Hij had radicale ideeën over de chirurgische opleiding en pleitte voor een verlengde chirurgische leertijd na voltooiing van de medische studie, bestaande uit voorbereidend werk in ziekenhuizen gevolgd door het uitvoeren van operaties op kadavers en proefdieren. Dit zou worden gevolgd door een assistentschap van 2-3 jaar op een chirurgische afdeling met studie van de chirurgische literatuur en de verwerving van geavanceerde praktische vaardigheden. Onder zijn leerlingen waren grootheden als Alexander von Winiwarter, Jan Mikulicz-Radecki en John B. Murphy. William Halsted’s baanbrekende chirurgische programma werd sterk beïnvloed door Billroth’s eigen methoden van chirurgisch onderwijs.