In 1993, toen Santoro Journalistiek studeerde aan de PUC-Rio, ging hij naar de Actor Workshop van Rede Globo. Santoro speelde rollen in veel van Globo’s telenovelas, zoals Olho no Olho (1993), Pátria Minha (1994), Explode Coração (1995), O Amor Está no Ar (1997), Suave Veneno (1999) en Mulheres Apaixonadas (2003), evenals in de miniserie Hilda Furacão (1998), in de rol van een priester. Santoro was ook de stemacteur van het titulaire personage in Stuart Little en het vervolg daarop in de Braziliaanse nagesynchroniseerde kopieën.
Zijn eerste grote rol in een filmproductie kwam in 2001, met Bicho de Sete Cabeças (Brainstorm) van de Braziliaanse regisseur Laís Bodansky. Aan het eind van de film kreeg hij een staande ovatie van het publiek. Hij won ook de trofee voor beste acteur van het festival. Na Bicho was zijn reputatie als acteur bevestigd en werd hij gecast als de mannelijke hoofdrol in Abril Despedaçado (Behind the Sun), één van de genomineerden voor beste buitenlandse film bij de 2002 Golden Globe Awards. In de Hector Babenco film Carandiru uit 2003 speelde hij Lady Di, een transseksuele gevangene.
De Canadese regisseur Robert Allan Ackerman tekende Santoro voor zijn TV productie The Roman Spring of Mrs. Stone nadat hij gebiologeerd was door zijn optreden in Bicho de Sete Cabeças. Omdat Santoro geen agent had in Noord-Amerika, nam Ackerman contact op met Santoro’s vader. Hij bracht twee maanden door met filmen in Rome, aan de zijde van bekende acteurs als Helen Mirren en Anne Bancroft. Kort nadat hij klaar was met de opnames voor Mrs. Stone, kreeg hij een aanbod van Columbia Pictures voor een rol in de blockbuster Charlie’s Angels: Full Throttle. Zijn optreden in Charlie’s Angels was de start van zijn carrière in Hollywood. Na Charlie’s Angels speelde hij het personage van Karl, de raadselachtige hoofdontwerper en liefdesinteresse van Laura Linney’s personage, in de romantische komedie Love Actually, waarin ook Colin Firth, Lucia Moniz, Hugh Grant, Emma Thompson, Keira Knightley en Rowan Atkinson te zien zijn.
Hij begon ook werk te krijgen in de reclamewereld toen hij verscheen in een reclamecampagne met Gisele Bündchen in 2002. Hij speelde de mannelijke hoofdrol in No. 5 The Film, de 3 minuten durende commercial voor Chanel, geregisseerd door Baz Luhrmann naast Nicole Kidman in 2004.
In 2006 kwam Santoro bij de cast van Lost als overlevende van Oceanic Flight 815, Paulo. Zijn eerste optreden was in de aflevering getiteld “Further Instructions”. Zijn personage werd vermoord in de aflevering “Exposé”. Hij stemde ook zijn personage Paulo in de Portugese dub voor Brazilië.
Santoro werd gecast als de Perzische keizer Xerxes in de film 300, gebaseerd op de gelijknamige comic van Frank Miller, in 2006. De rol had veel speciale vereisten, zoals intensieve training voor de lichamelijkheid van de rol (Santoro was 24 pond afgevallen om te werken in een Braziliaanse miniserie), uitgebreide CG-werk om de 6’2 “Santoro te portretteren als de 7 voet lange God-Koning, een vier en een half uur durende make-up proces en de volledige verwijdering van Santoro’s lichaamshaar eerst door harsen en vervolgens door scheren toen dat te pijnlijk bleek. Zijn wenkbrauwen werden echter intact gelaten, overdekt met protheses en naar binnen getrokken in plaats van geschoren. Santoro las de werken van Herodotus, een Oudgriekse historicus, om zich voor te bereiden op zijn rol. Over Xerxes heeft hij het volgende verklaard:
Hij is rijk, hij is arrogant, hij is een zeer onstabiele megalomaan. Hij wil gewoon de wereld veroveren. Zijn ambitie is onbegrensd. Hij wil glorie, hij wil de overwinning, hij wil eeuwige roem. Maar onder al dat willen is hij uiteindelijk zwak en erg onzeker.
Voor zijn rol in 300 werd Santoro als eerste Braziliaanse acteur genomineerd voor de MTV Movie Awards in de categorie Best Villain. Hij won echter niet, en de prijs ging naar Jack Nicholson voor The Departed.
Hij speelde de overleden voetballer Heleno de Freitas in de film Heleno uit 2012. Santoro speelde samen met Arnold Schwarzenegger in de film The Last Stand uit 2013. Santoro speelde Garriga in de Will Smith dramafilm Focus (2015).
Santoro speelde Jezus in de historische actiefilm Ben-Hur uit 2016 en kreeg voor deze rol de persoonlijke zegen van paus Franciscus.