Matlin maakte haar toneeldebuut op zevenjarige leeftijd, als Dorothy in een kindertheatervoorstelling van The Wizard of Oz van het International Center on Deafness and the Arts (ICODA), en bleef gedurende haar hele jeugd optreden met de ICODA-kindertheatergroep.
Haar ontdekking door Henry Winkler tijdens een van haar ICODA-theateroptredens leidde uiteindelijk tot haar filmdebuut in Children of a Lesser God (1986). De film kreeg over het algemeen positieve kritieken en Matlins vertolking als Sarah Norman, een doofstomme vrouw die niet wil praten en valt voor een horende man, oogstte veel lof: Richard Schickel van TIME magazine schreef: “Ze heeft een ongewoon talent om haar emoties – en die van het publiek – te concentreren in haar gebarentaal. Maar er is hier iets meer, een ironische intelligentie, een felle maar niet afstandelijke humor, die de films, met hun beroemde vermogen om gedachten te fotograferen, in zeer weinig voorstellingen ontdekken”. Roger Ebert van de Chicago Sun-Times was ook onder de indruk van Matlin en schreef: “Ze houdt stand tegen de krachtpatser waarmee ze acteert, ze draagt scènes met passie en een bijna pijnlijke angst om afgewezen en gekwetst te worden, waar haar rebellie eigenlijk om draait,” en Paul Attasanio van de Washington Post zei: “De meest voor de hand liggende uitdaging van de rol is om te communiceren zonder te spreken, maar Matlin gaat dat aan op dezelfde manier als de sterren uit het stille tijdperk deden — ze acteert met haar ogen, haar gebaren.” Children of a Lesser God leverde haar een Golden Globe Award op voor Beste Actrice in een Drama en een Academy Award voor Beste Actrice. Matlin was toen pas 21 jaar oud en bleef daarmee de jongste actrice die een Oscar kreeg in de categorie Beste Actrice; ze is nog steeds de enige dove Academy Award-ontvanger in welke categorie dan ook.
Twee jaar later maakte ze een gastoptreden in Sesamstraat met Billy Joel die een herziene versie van “Just the Way You Are” uitvoerde met teksten van Tony Geiss. Matlin gebruikte gebarentaal tijdens het lied en omhelsde Oscar the Grouch tijdens de afsluiting van het lied. Een jaar later nodigde Billy Joel haar uit om op te treden in zijn video voor “We Didn’t Start the Fire”.
In 1989 vertolkte Matlin een dove weduwe in de televisiefilm Bridge to Silence. In die rol sprak ze, naast het gebruik van gebarentaal. Het tijdschrift People vond de film niet goed, maar prees Matlin’s werk en schreef: “de mooie, emotioneel ontroerende Matlin is te goed voor dit goedbedoelde maar sentimentele prul.” Ze werd genomineerd voor een Golden Globe voor haar werk als de vrouwelijke hoofdrol in de televisieserie Reasonable Doubts (1991-1993). Matlin werd genomineerd voor een Emmy Award voor haar gastrol in Picket Fences (1992) en werd een vaste rol in die serie tijdens het laatste seizoen (1996). Ze speelde Carrie Buck in het televisiedrama Against Her Will: The Carrie Buck Story, gebaseerd op de zaak Buck v. Bell 274 U.S. 200 uit 1927 van het Hooggerechtshof van de Verenigde Staten. In die rol vertolkte Matlin voor het eerst in haar carrière een horende vrouw, wat haar een CableACE-nominatie voor Beste Actrice opleverde. Ze had een prominente bijrol in het drama It’s My Party (1996).
Matlin had later terugkerende rollen in The West Wing, en Blue’s Clues. Andere televisie-optredens zijn Seinfeld (“The Lip Reader”), The Outer Limits (“The Message”), ER, The Practice, en Law & Order: Special Victims Unit. Ze werd genomineerd voor Primetime Emmy Awards voor haar gastrolletjes in Seinfeld, Law & Order: Special Victims Unit, en The Practice.
Ted Koppel spreekt met Gregory Hlibok, Elizabeth Zinser en Marlee Matlin in ABC’s Nightline op 9 maart 1988, Youtube-video
In 2002 publiceerde Matlin haar eerste roman, getiteld Deaf Child Crossing, dat losjes gebaseerd was op haar eigen jeugd. Later schreef en publiceerde ze een vervolg getiteld Nobody’s Perfect, dat in oktober 2007 werd opgevoerd in het John F. Kennedy Center for Performing Arts in samenwerking met VSA Arts. In 2004 speelde ze de hoofdrol in de film What the Bleep Do We Know als Amanda. In 2003 presenteerde ze het 3e jaarlijkse filmfestival voor doven in Chicago.
In 2006 speelde ze een dove ouder in Desperate Housewives. Ze had een terugkerende rol in My Name Is Earl als openbare verdediger van Joy Turner (die veel grappen maakte over Matlins doofheid ten koste van Matlin), en speelde de moeder van een van de slachtoffers in een aflevering van CSI: NY. Datzelfde jaar werd Matlin gecast in seizoen 4 van The L Word als Jodi Lerner, een lesbische beeldhouwster. Ze verscheen in seizoen 4 (2007), seizoen 5 (2008), en seizoen 6 (2009) als de vriendin van een van de hoofdrolspelers van de show, Bette Porter, gespeeld door Jennifer Beals.
Op 4 februari 2007, en 7 februari 2016, vertolkte Matlin de “Star Spangled Banner” in Amerikaanse gebarentaal tijdens de Super Bowl XLI in Miami, Florida, en tijdens de Super Bowl 50 in Santa Clara, Californië, respectievelijk. In januari 2008 was ze te zien in Nip/Tuck als televisieleider.
In 2008 deed Matlin mee als deelneemster aan het zesde seizoen van ABC’s Dancing with the Stars. Haar danspartner was nieuwkomer Fabian Sanchez. Matlin en Sanchez werden als zesde koppel geëlimineerd uit de competitie.
Op 6 mei 2009 ontving Matlin een ster op de Hollywood Walk of Fame.
Op 8 november 2009 verscheen Matlin in Seth & Alex’s Almost Live Comedy Show, gehost door Seth MacFarlane en Alex Borstein. Nadat Borstein Matlin imiteerde door MovieFone te bellen en “Poker Face” te zingen, verscheen Matlin zelf en begon een komische tirade tegen Borstein over het feit dat ze belachelijk was gemaakt en dat ze niet was uitgenodigd om haar eigen stem voor Family Guy te verzorgen. Matlin ging verder met de stem van Stella, de collega van Peter Griffin, in de aflevering “The Blind Side” van seizoen 10; Stella werd later een terugkerend personage.
In 2010 produceerde Matlin een pilot voor een reality show met de titel My Deaf Family, die ze presenteerde aan verschillende nationale netwerk executives. Hoewel ze interesse toonden, kocht geen enkel netwerk de rechten voor de show. Op 29 maart 2010 uploadde Matlin de pilot naar YouTube en lanceerde een virale marketing campagne.
Op 26 juli 2010 ondertekende Matlin een toespraak op een evenement ter herdenking van de 20e verjaardag van de Americans with Disabilities Act.
In het volgende jaar was Matlin finalist in de NBC-show The Celebrity Apprentice, waar ze streed om geld te winnen voor haar goede doel, The Starkey Hearing Foundation, en eindigde op de tweede plaats. Echter, in een aflevering van The Celebrity Apprentice, “The Art of the Deal”, die werd uitgezonden op 3 april 2011, haalde ze meer geld op dan ooit tevoren in een enkele gebeurtenis in een televisieshow was opgehaald voor een goed doel, namelijk $986.000. Donald Trump, die toen gastheer was van The Celebrity Apprentice, doneerde vervolgens nog eens $14.000 om de bijdrage zelfs op een miljoen te brengen.
In 2013 speelde Matlin zichzelf in No Ordinary Hero: The SuperDeafy Movie. Vanaf januari 2015 trad Matlin ook op als celebrity-ambassadeur van de ACLU voor gehandicaptenrechten.
Als “celebrity-ambassadeur” voor de ACLU, in pogingen om de kloof tussen wetshandhaving en de dovengemeenschap te overbruggen, besprak Matlin de communicatiebarrières wanneer dove individuen worden aangehouden door de politie.
Matlin speelde het terugkerende personage van Melody Bledsoe op Switched at Birth. In september 2015 maakte ze haar Broadway-debuut in de revivalproductie van de musical Spring Awakening.
Begin 2017 speelde Matlin de terugkerende rol van Harriet in de Syfy-televisieserie The Magicians.
Op 31 juli 2017 werd door Deadline bekendgemaakt dat Matlin toetrad als series regular in het derde seizoen van de ABC-thriller Quantico. Ze speelde de rol van ex-FBI-agente Jocelyn Turner.
In 2019 werd Marlee Matlin in een artikel van Hearing Like Me genoemd als iemand die meer #DeafTalent zou kunnen brengen in “Life and Deaf,” een nieuwe komedieshow die het leven van een kind met dove ouders wil verkennen. De nieuwe serie, die zich afspeelt in de jaren ’70, heeft de bekroonde actrice en dovenactiviste Marlee Matlin in de hoofdrol. Deze show zou volgens Deadline executive geproduceerd worden door Marlee Matlin.