We hebben allemaal wel eens gehoord over centrifugeren, of meer specifiek, de horrorverhalen over centrifugeren dat misgaat, zoals in het geval van het beroemde Cornell-centrifuge-ongeval. De meeste blunders in verband met centrifugeren zijn te wijten aan een slechte behandeling door de gebruiker. Daarom is het van cruciaal belang te begrijpen waarom we tijdens het centrifugeren doen wat we doen om schade aan de machine en het personeel te voorkomen. Hier heb ik enkele van de meest voorkomende problemen opgesomd die tijdens het centrifugeren gemakkelijk over het hoofd kunnen worden gezien en waarom ze zo belangrijk zijn voor een juiste behandeling van een centrifuge.
Het draait allemaal om balans
Centrifugatie produceert centrifugale krachten om de monstercomponenten effectief te scheiden op basis van grootte en dichtheid. Kleine onevenwichtigheden in het gewicht kunnen abnormale trillingen veroorzaken die de rotor kunnen beschadigen. Een centrifuge die niet in evenwicht is, is even gevaarlijk als een onstabiele chemische reactie. Het kan niet alleen het instrument beschadigen, maar ook een domino-effect van catastrofes op gang brengen, gaande van defecten aan het instrument tot breuk van het monster, waardoor potentieel schadelijke verontreinigende stoffen in het milieu kunnen vrijkomen (besmettelijke monsters, schadelijke aërosolen, enz.
A) De noodzaak van nauwkeurig uitbalanceren bij hoge snelheden
Nauwkeurig uitbalanceren is van cruciaal belang bij centrifugeren bij hoge snelheden. Om dit beter te begrijpen, moeten we teruggaan naar enkele basisbegrippen uit de natuurkunde. Volgens de tweede wet van Newton is kracht (F) gelijk aan massa (M) maal versnelling (A). De centrifugaalkracht die tijdens het centrifugeren wordt opgewekt, is dus recht evenredig met de massa en de versnelling van het monster. Bij cirkelvormige bewegingen is de versnelling gerelateerd aan de rotatiesnelheid en de straal van de rotor. Bij hoge snelheden kunnen zelfs kleine variaties in de monstermassa leiden tot een aanzienlijke krachtonevenwichtigheid, die catastrofaal kan zijn.
B) Uitbalanceren op basis van rotortype
Of de centrifuge nu een rotor met vaste hoek of een swing-bucket rotor heeft, twee belangrijke factoren die bij het uitbalanceren in aanmerking moeten worden genomen zijn het monstervolume en de symmetrische opstelling van de buisjes. Het is belangrijk ervoor te zorgen dat de monstervolumes in alle buisjes gelijk zijn en dat de buisjes recht tegenover elkaar in de centrifuge worden geplaatst. Als er een oneven aantal buisjes is, moet dit worden vereffend door een extra buisje met water toe te voegen met hetzelfde volume als de experimentele buisjes. Indien de oplossingen niet dezelfde dichtheid hebben (b.v. aceton en water), moeten de buisjes een gelijke massa hebben en niet hetzelfde volume om correct in evenwicht te zijn. Een bijkomende factor waarmee rekening moet worden gehouden in het geval van zwenk-emmerrotors is ervoor te zorgen dat alle gleuven rotoremmers bevatten die geschikt zijn voor de machine en van hetzelfde gewicht zijn.
2. RCF vs. RPM en waarom het belangrijk is
RCF (relatieve centrifugale kracht of g-kracht) en RPM (omwentelingen per minuut) worden algemeen gebruikt om de centrifugale snelheid te beschrijven. Deze eenheden zijn echter totaal verschillend. RPM geeft de rotatiesnelheid aan, die afhangt van de rotorradius. De RCF geeft de centrifugale kracht op de monsters aan en houdt rekening met zowel de rotorradius als de rotatiesnelheid. Dezelfde RCF kan worden bereikt in centrifuges met verschillende rotorafmetingen door het toerental op de juiste wijze aan te passen. Dit maakt RCF tot de meest gebruikte eenheid om centrifugesnelheden te beschrijven, aangezien deze kan worden vergeleken tussen centrifuges, terwijl het toerental alleen constant is voor centrifuges met dezelfde rotorradius. Eenvoudig gezegd, RPM is niet gelijk aan RCF, en RPM snelheidsinstellingen moeten worden omgezet in RCF om ervoor te zorgen dat de juiste centrifugale kracht wordt toegepast.
3. Tijd, snelheid en centrifugeren
De keuze van de centrifugatiesnelheid hangt af van de grootte en de breekbaarheid van de deeltjes in het monster. Hoe kleiner de deeltjesgrootte, hoe hoger de centrifugatiesnelheid. Bacteriële cellen worden bijvoorbeeld gepelleteerd bij hogere snelheden (2000-10.000 x g) dan zoogdiercellen (500-2000 x g). Bovendien kunnen lagere centrifugatiesnelheden worden gebruikt voor kwetsbaardere monsters.
Een andere kritische factor die van invloed is op de efficiëntie van de scheiding is RCF. De RCF is evenredig met de straal van de rotor en met het kwadraat van het toerental. Door deze kwadratische afhankelijkheid van de RCF van het toerental zijn centrifugatiesnelheden van 1000 omwentelingen per minuut gedurende 5 minuten en 500 omwentelingen per minuut gedurende 10 minuten niet onderling verwisselbaar. De eerste levert een veel grotere RCF op dan de tweede. Het is dus belangrijk de RCF in aanmerking te nemen bij het bepalen van de snelheid en de tijd voor uw centrifugatie.
4. Centrifugeren bij verschillende temperaturen
Centrifugeren wekt warmte op, waardoor de temperatuur in een centrifuge kan stijgen (soms met meer dan 15°C). Dit kan de stabiliteit van temperatuurgevoelige monsters aantasten. In dergelijke gevallen wordt gewoonlijk de voorkeur gegeven aan centrifuges met koeling. In een ambient centrifuge kan echter ook een constante temperatuur worden aangehouden. De monstertemperatuur tijdens het centrifugeren wordt voornamelijk beïnvloed door drie factoren: het rotormateriaal, de rotorvorm en de rotatiesnelheid.
A) Rotormateriaal
Tijdens het centrifugeren kan de temperatuur worden beïnvloed door de thermische geleidbaarheid van het rotormateriaal. Rotors van metaal, zoals staal en aluminium, hebben een hoge dichtheid en een hoge thermische geleidbaarheid. Zij dragen warmte efficiënt over en raken snel afgekoeld. Materialen als polymeren en koolstofvezels daarentegen zijn warmte-isolerend en houden de temperatuur constant.
B) Vorm van de rotor
De vorm van de rotor bepaalt de luchtstroom binnen een centrifuge, vergelijkbaar met hoe de bladen van een elektrische ventilator de luchtstroom in en uit de machine beïnvloeden. Het optimaliseren van de luchtstroom in een centrifuge door de vorm van de rotor is essentieel voor het handhaven van de temperatuur.
C) Snelheid
De rotatiesnelheid is recht evenredig met de temperatuurstijging – bij hogere snelheden wordt meer warmte gegenereerd. Het is belangrijk te weten wat de maximumsnelheid van de centrifuge is en met welke snelheden een temperatuurbereik kan worden gehandhaafd dat de uitkomst van het experiment niet zal veranderen. Meestal zal deze informatie door de fabrikant in de handleiding van de apparatuur worden verstrekt om de gebruiker te helpen de beperkingen te begrijpen en eromheen te werken.
5. To Brake or Not to Brake
Tijdens het centrifugeren gaat de scheiding van de monsterbestanddelen door tijdens de vertragingsfase. Veel centrifuges bieden de mogelijkheid om de deceleratie-instellingen (remmen) te regelen om sneller tot stilstand te komen, maar wanneer hebben we deze optie echt nodig, en wat is het effect op de monsterresultaten?
Remmen kan vooral nuttig zijn tijdens centrifugaties waarbij nucleïnezuur wordt geëxtraheerd of bacteriële cellen worden gepelletiseerd, die niet worden beïnvloed door plotselinge stopzetting. Bij experimenten die gevoeliger zijn voor abrupte vertraging, zoals de isolatie van mononucleaire cellen uit perifeer bloed en gradiëntcentrifugaties, kan remmen ertoe leiden dat gescheiden lagen zich opnieuw vermengen. In dergelijke gevallen is het geschikter de rem uit te schakelen, zodat de vertraging geleidelijk verloopt en de gradiënten niet worden verstoord. Sommige centrifuges bieden een reeks van vertragingsinstellingen. Dit kan nuttig zijn bij het centrifugeren van zoogdiercellen, die gevoelig zijn voor plotselinge vertragingen, maar tegelijkertijd enige vertraging nodig hebben om de tijd die de centrifuge nodig heeft om tot stilstand te komen, zo kort mogelijk te houden.
6. Waar is de pellet?
Een van de meest gebruikelijke toepassingen van centrifugeren is het pelleteren van monsters, zoals bacteriële cellen, zoogdiercellen of nucleïnezuren. Bij gebruik van een rotor met een vaste hoek bepaalt de hoek van de rotor de positie van het pellet. Om er zeker van te zijn dat u altijd weet waar uw pellet zich bevindt, is het een goede laboratoriumpraktijk om de buisjes altijd te draaien met de scharnieren van het deksel in dezelfde richting (bijvoorbeeld de scharnieren van het deksel naar buiten gericht). Dit is vooral nuttig om monsterverlies tijdens DNA-extracties te voorkomen, wanneer de pellet na de ethanolwasstap bijna onzichtbaar is. In het geval van swing-bucket rotors worden de pellets meestal op de bodem van de buis gevormd.
Al met al hoop ik dat het lezen van dit artikel u helpt om comfortabeler en zelfverzekerder met centrifuges te werken. Als u een centrifuge-ramp hebt meegemaakt of meegemaakt, deel dan uw verhaal met tips en trucs om gelukkig te kunnen centrifugeren in de reacties hieronder. Moge de kracht met u zijn!
- Eppendorf. Centrifuge Veiligheid.
- Eppendorf. Thermische geleidbaarheid.
- Sigma. Monstertemperatuur tijdens High Throughput Centrifugeren bij omgevingstemperatuur met Sigma 4-5L.
- Owen Mitch Griffith. Sample Re-mixing During Density Gradient Separations with Thermo Scientific Fiberlite F21-8x50y mL Fixed-Angle Rotor.
Heeft dit u geholpen? Deel het dan met uw netwerk.