Human sample source
Een totaal van 133 2PN-stadium menselijke embryo’s gebruikt in de huidige studie werden verkregen van de Stanford University RENEW Biobank, met schriftelijke geïnformeerde toestemming dat ze werden gedoneerd voor niet-stam onderzoek. Alle embryo’s waren ingevroren in het zygotische of 2PN-stadium, en het is zeer waarschijnlijk dat deze embryo’s de typische IVF-populatie vertegenwoordigen, aangezien ze niet geselecteerd werden vóór de cryopreservatie. De-identificatie werd uitgevoerd in overeenstemming met het protocol ‘The RENEW Biobank’, dat werd goedgekeurd door de Stanford University Institutional Review Board. Er werden geen beschermde gezondheidsgegevens in verband gebracht met de embryo’s. Van de 133 ontdooide embryo’s bleken er 91 na het ontdooien nog in leven te zijn; de rest werd uitgesloten omdat ze zichtbaar niet levensvatbaar waren (vóór het opzuigen van een micropipet). Nog eens twee embryo’s werden van onze gegevens uitgesloten omdat ze tijdens het opzuigen van de micropipet structureel beschadigd waren en omdat de ZP was gescheurd, zodat we in totaal 89 menselijke embryo’s in onze gegevensverzameling overhielden. Deze 89 menselijke embryo’s werden ontdooid en gemeten in kleinere groepen in de loop van zes afzonderlijke experimenten.
Human embryo cultuur
Human embryo’s werden ontdooid met behulp van een Quinn’s Advantage Thaw Kit (CooperSurgical) zoals eerder beschreven26,27. In het kort, werden cryovials of rietjes verwijderd uit de vloeibare stikstof tank en blootgesteld aan lucht alvorens te worden geplaatst in een 37 ° C waterbad. Eenmaal ontdooid, werden embryo’s geïncubeerd in 0,5 en 0,2 M sucrose ontdooiing medium bij 37 ° C gedurende 10 min elk. De embryo’s werden vervolgens gewassen in ontdooiverdunningsvloeistof bij 37 °C en gedurende 3-4 uur gekweekt in Quinn’s advantage klievingsmedium (CooperSurgical), aangevuld met 10% serumeiwitvervanger (CooperSurgical). In sommige experimenten werden embryo’s gecontroleerd op hun ontwikkeling met behulp van de Eeva System (Auxogyn).
Muis embryo en eicel collectie en IVF
Hybride stam (C57B6xDBA2) F1 muizen (4-6-weken oude vrouwtjes) werden gekocht van Jackson Laboratory en onderhouden in de dierlijke faciliteit in de Lorry Lokey Stem Cell Research Building. Alle experimenten werden uitgevoerd onder Institutional Animal Care and Use Committee protocol # 1646, die werd goedgekeurd door de administratieve Panel voor Laboratory Animal Care aan de Stanford University. Kort gezegd, werden vrouwelijke muizen superovulated door intraperitoneale injectie van 10IU zwangere merrie serum gonadotrofine (PMSG, Sigma) 10IU humaan choriongonadotrofine (hCG, Sigma). Na paring een vrouwtje met een 8-10 weken oude man van dezelfde stam, cumulus-oocyte complexen werden verzameld uit eileiders in M2 media (Millipore) en cumulus cellen werden verwijderd in hyaluronidase (Sigma) en gewassen in M2 media. Na mechanische metingen werden de embryo’s gekweekt in Quinn’s advantage cleavage medium (CooperSurgical) met 10% serumeiwitvervanger (CooperSurgical). Om het effect van de rijping van de oöcyten op de mechanica te meten, werden de oöcyten in verschillende stadia van rijping verzameld. GV oöcyten werden verzameld 48 uur na injectie van PMSG. Ongeveer 48 uur na de injectie van PMSG werd hCG geïnjecteerd. MI oöcyten werden 5-6 uur na de hCG injectie verzameld, en MII oöcyten werden 18-20 uur na de hCG injectie verzameld.
Embryo’s werden uitgesloten van onze gegevens als ze een zeer slechte morfologie vertoonden, als ze afkomstig waren van muizen die minder dan 10 embryo’s produceerden of als ze in een groep zaten waar minder dan 40% van de embryo’s pronucleusvorming vertoonden na IVF. Als de muizen te weinig embryo’s produceerden of als het bevruchtingspercentage te laag was, gingen we ervan uit dat bepaalde onderdelen van het experimentele protocol (hormooninjectie, media, enzovoort) de embryo’s negatief beïnvloed moeten hebben en dat ze dus misschien niet representatief waren voor normale muizenembryo’s. Om de embryo’s in controle- en meetgroepen in te delen, werden ze willekeurig van elkaar gescheiden terwijl ze bij een zodanige vergroting werden bekeken dat de morfologie moeilijk te onderscheiden was. Slechts een paar embryo’s werden gehouden als negatieve controles in elk experiment, bij elkaar opgeteld tot een totaal van 35 over alle experimenten (Supplementary Fig. 5). Steekproefgroottes voor dierproeven werden deels bepaald door de hoeveelheid gegevens die nodig zijn om statistische significantie te bereiken, en deels door steekproefgroottes gezien in publicaties met soortgelijk onderzoek. Mechanische en blastocystvorming gegevens voor de 282 muis embryo’s die we gemeten (Supplementary Fig. 4 en Supplementary Fig. 5) werden verzameld in de loop van 15 afzonderlijke experimenten.
Microinjectie van muis oöcyten en IVF
Een CBA muis stam van Jackson Laboratory werd gebruikt in dit experiment. Na geïnduceerde superovulatie van 4-6 weken oude vrouwelijke muizen, werden metafase-II-arrested oöcyten verzameld en cumuluscellen verwijderd. Oöcyten werden vervolgens geïnjecteerd met ∼10 pl monoklonaal antilichaam 18A10 (abCam) bij een concentratie van 1 mg ml-1. Sommige oöcyten werden als negatieve controles bewaard en ondergingen ofwel een schijninjectie met water of helemaal geen injectie. De oöcyten werden vervolgens gedurende een uur gekweekt vóór conventionele IVF. Sperma’s werden verzameld van 8-10 weken oude CBA mannetjes (Jackson Laboratory) en mochten 45 min voor inseminatie capaciteren in HTF media (CooperSurgical). Een passende hoeveelheid van de spermasuspensie werd toegevoegd aan de mediadruppel waarin oöcyten werden gekweekt. Geen monsters werden uitgesloten van dit experiment, en oöcyten werden gesorteerd in controle versus gemeten groepen zonder rekening te houden met morfologie en in een willekeurige volgorde.
Meting van embryo mechanische eigenschappen
Een geautomatiseerde micropipet aspiratie systeem werd gebruikt om de embryo’s te meten, en een op maat gebouwde lichtmicroscoop werd gebruikt om video op te nemen van de aspiratie. De lichtmicroscoop werd gebouwd met onderdelen van Thorlabs, en maakt gebruik van een Olympus objectief met × 20, 0,4 numerieke apertuur en verlichting met witte lichtemitterende diode. Om een meting uit te voeren, wordt elk embryo in zijn eigen druppel medium geplaatst en wordt de micropipet in de druppel neergelaten. Het embryo wordt gemanipuleerd met de pipet, zodat de polaire lichaam is weg gericht van de pipet opening. Het niet controleren van de meetpositie zou onze resultaten kunnen verwarren, omdat er een ruimte is tussen de oolemma en ZP dicht bij het polaire lichaam, terwijl deze perivitelline ruimte veel kleiner is rond de rest van het embryo. Studies hebben ook aangetoond dat oöcyt corticale spanning is gepolariseerd ten opzichte van de meiotische spindel 66; Daarom hebben we ervoor gezorgd om het einde van het embryo tegenover het polaire lichaam, dat meestal dicht bij de spindel te meten.
Micropipetten voor het meten van muizenembryo’s had 40-μm binnendiameter (Origio MBB-FP-L-15); die voor menselijke embryo’s had 70-μ binnendiameter en werden op maat gemaakt door Origio. Een houddruk van -0.03 p.s.i. wordt toegepast om het embryo te houden en de pipetopening af te sluiten. Vervolgens wordt een stapsgewijze druk van -0.345 p.s.i. op het embryo uitgeoefend. De gewenste druk wordt toegepast met behulp van een gesloten-lus PID-regelsysteem. Een lineaire actuator (Firgelli L12) beweegt de stop van een 1-ml-spuit, en een sensor (Honeywell SSCSNBN010NDAA5) meet de druk. Deze zijn verbonden met een computer via een Arduino Uno microcontroller die de sensorwaarden kan doorgeven en de actuator in real time commando’s kan geven. Een video van de aspiratie wordt opgenomen bij 75 f.p.s. met een CMOS camera (Thorlabs DCC1545M). Alle hardware wordt bestuurd met behulp van de op maat gemaakte Labview-software (National Instruments). Een geautomatiseerd, op maat gemaakt Matlab-programma (Mathworks) werd gebruikt om de aspiratiediepte van het embryo te extraheren en te passen in een mechanisch model. Canny edge detection en dresholding werden gebruikt om pipet hoek en opening te identificeren. Cross-correlatie gebaseerde template matching werd gebruikt om automatisch embryo rand te volgen in de tijd om bias van handmatige metingen te verwijderen. Tijdens de meting van embryo mechanische parameters, de onderzoeker was geblindeerd op de vraag of ze overleefden tot de blastocyst stadium of niet, of tot welke groep ze behoorden (in het geval van de micro-injectie experimenten).
Mechanisch model van een-cel embryo
Een gemodificeerde lineaire elastische vaste stof model (gemodificeerde Zener-model) werd gebruikt om het embryo te vertegenwoordigen als het werd opgezogen in de micropipet. Uitgaande van een stapsgewijze invoer van de kracht die op het embryo wordt uitgeoefend, luidt de vergelijking voor de aspiratiediepte in de tijd
Waar
Het gemodificeerde Zener-model werd verkozen boven andere veelgebruikte visco-elastische modellen, zoals het Maxwell, Kelvin-Voigt en Zener (Standard Linear Solid) op basis van visuele inspectie van de responsdynamica. We zagen in onze experimenten dat de reactie van een embryo op een stapsgewijze drukinput een onmiddellijke rek was, gevolgd door een exponentiële vervalcomponent (omgekeerd zodat de vervorming in de loop van de tijd toenam), uiteindelijk gevolgd door vervorming met een constante snelheid zoals getoond in Fig. 2c.
Een Maxwell-lichaam bestaat uit een veer en een dashpot in serie; daarom is zijn reactie op een stapsgewijze druk een onmiddellijke rek, gevolgd door een gestage lineaire vervorming. Omdat onze gegevens een duidelijke exponentiële component vertoonden, werd dit model ontoereikend geacht om ons systeem te beschrijven. Een Kelvin-Voigt-lichaam bestaat uit een parallel geschakelde veer en dashpot; daarom is de respons op een stapsgewijze druk een afnemende exponentiële vervorming waarbij de aanzuigdiepte zich stabiliseert op een uiteindelijke maximumdiepte. Dit model geeft niet de onmiddellijke rek weer die het embryo ondervindt, noch de lineaire vervormingssnelheid nadat de exponentiële component tot rust is gekomen. Het Zener-model voegt een extra veer toe parallel aan het Maxwell-lichaam en de reactie op druk is vergelijkbaar met die van een Kelvin-Voigt-lichaam, maar met een onmiddellijke uitrekking wanneer de druk voor het eerst wordt uitgeoefend. Toch is dit model vereist de toevoeging van een extra dashpot in serie met de andere drie componenten om nauwkeurig vast te leggen de lineaire vervorming ervaren door het embryo na de exponentiële component geregeld.
Een vergelijking van de fitting fout voor vijf verschillende modellen wordt getoond in aanvullende Fig. 10. Ons model (dat 4 parameters heeft) lijkt geschikt omdat de fout bijna net zo laag is als de fout van het vijf-parameter model, met of zonder de onnodige extra parameter. We geloven daarom dat ons model nauwkeurig de gegevens beschrijft zonder overfitting.
Beoordeling van de levensvatbaarheid van embryo’s en celcyclusparameters
Blastocystvorming werd gebruikt als een proxy voor levensvatbaarheid bij het construeren van een classificator om levensvatbare en niet-levensvatbare embryo’s te onderscheiden op basis van mechanica. Deze classificator werd gevalideerd in de muis, zoals blijkt uit de levendgeboren experimenten in Fig. 2. Nadat de mechanische parameters van het embryo op dag 1 waren gemeten, werden de embryo’s gedurende 5-6 dagen in het Auxogyn Eeva-systeem gekweekt, waarbij elke 5 min. beelden werden vastgelegd. Celcyclus parameters27 werden geëxtraheerd uit de resulterende video’s, en embryo’s die blastocysten vormen op dag 5 (muis) of dag 6 (mens) werden gecategoriseerd als levensvatbaar.
Embryo levensvatbaarheid voorspelling
Blastocyst overleving werd gebruikt als ground truth informatie voor het trainen van een classifier om de levensvatbaarheid van embryo’s te voorspellen op basis van dag 1 mechanische metingen. Een binaire SVM classifier met een RBF kernel werd getraind op de mechanische parameters van het embryo. Optimale waarden voor de box constraint (c) en RBF sigma (σ) werden gekozen met behulp van 10-voudige kruisvalidatie. Zodra de optimale SVM-parameters waren bepaald, werden 100 Monte Carlo-simulaties van 10-voudige kruisvalidatie uitgevoerd om het gemiddelde gebied onder de ROC-curve en PR-curve te berekenen.
Omdat in totaal vier mechanische parameters werden gemeten voor elk embryo, werd voorwaartse selectie van kenmerken uitgevoerd om het optimale aantal parameters te bepalen om op te nemen in onze levensvatbaarheidsclassificator. De resultaten van dit proces zijn weergegeven in supplementaire Fig. 2C, waaruit blijkt dat er een grote verbetering bij gebruik van twee parameters in plaats van een, en een lichte verbetering bij het toevoegen van een derde parameter. Het gebruik van alle vier parameters vermindert de effectiviteit van onze classificator, omdat de vierde parameter niet nuttig is voor het scheiden van embryo’s op levensvatbaarheid, maar een extra dimensie aan de gegevens toevoegt.
Om forward feature selection uit te voeren, werd eerst elke parameter op zichzelf gebruikt om embryo’s te scheiden en werd een optimale classificator gevonden. Zoals hierboven beschreven, werd 10-voudige kruisvalidatie uitgevoerd om het gebied onder de ROC-curve voor die parameter te schatten. Zodra de parameter met de hoogste voorspellende waarde was gekozen, werd een nieuwe classificator getraind en geoptimaliseerd met behulp van elk van de resterende parameters. De parameter die de hoogste verbetering van de voorspellende waarde veroorzaakt werd toegevoegd aan de classificator, en het proces werd herhaald totdat er geen parameters overblijven.
Voor de experimenten op corticale granule release, werden de cijfers getoond met alleen de parameter die het meest voorspellend voor de levensvatbaarheid (stijfheid, k1) voor de eenvoud. De eerder opgeleide drie-parameter classificator werd gebruikt om embryo’s sorteren op levensvatbaarheid, maar we bepaalden de cijfers het duidelijkst bij gebruik van stijfheid only.
Muis levendgeboren experimenten
CD1 vrouwelijke muizen werden gekocht van Jackson Laboratory en gepaard met gesteriliseerde mannetjes om te dienen als pseudo-zwangere ontvangers. Muizen werden gehouden in dezelfde conditie als die gebruikt voor het embryo collectie. De mechanische parameters van embryo’s verzameld bij (C57B6xDBA2) F1 muizen werden gemeten en de embryo’s werden gesorteerd in levensvatbare of niet-levensvatbare groepen op basis van deze parameters. In elk experiment, een gelijk aantal een-cel stadium muis embryo’s (bereik van 10 tot 15) werden overgebracht naar de eileider van een onlangs geplugde embryo ontvangers. Dit experiment werd viermaal herhaald (aanvullende tabel 1), waarbij in elk experiment 10-15 embryo’s in elke muis werden overgebracht. De technicus die de embryo’s overplaatste was blind voor welke embryo’s in welke groep zaten. Hetzelfde aantal embryo’s in hetzelfde ontwikkelingsstadium werd willekeurig gekozen en overgebracht naar pseudo-zwangere muizen als controle. De pups werden verwacht op dag 20 na de operatie. Een χ2-test werd uitgevoerd om te testen of het verschil in aantal geboren pups in elke groep (levensvatbaar, niet-levensvatbaar of controle) statistisch significant was.
RNA-seq monstervoorbereiding
Twee afzonderlijke experimenten werden uitgevoerd met een totaal van 32 2PN menselijke embryo’s om monsters voor RNA-seq te verkrijgen. De embryo’s mochten na het ontdooien 3-4 uur herstellen in kweekmedia en de mechanische parameters werden gemeten. Elk embryo werd ingedeeld als levensvatbaar of niet-levensvatbaar op basis van de mechanische parameters. cDNA van elk embryo werd gesynthetiseerd uit totaal RNA met behulp van de SMARTer Ultra Low RNA kit (Clontech) volgens het protocol van de leverancier. Na Covaris scheren van full-length cDNA, werden de uiteindelijke bibliotheken gegenereerd met behulp van de NEBNext DNA Sample Prep Master Mix Set (New England Biolabs) en onderworpen aan kwaliteitscontrole met een Agilent 2100 bioanalyser. De resulterende monsters werden vervolgens ingediend voor single-cel RNA-seq op een Illumina HiSeq 2000 platform met behulp van de 100-bp paired-end sequencing strategie.
Van de 25 embryo’s gekozen voor sequencing, werden drie embryo’s uitgesloten als gevolg van technische problemen (geen RNA hersteld). We dienden een totaal van 22 embryo’s voor sequencing, die werden geclassificeerd als levensvatbaar of niet-levensvatbaar op basis van mechanische parameters.
RNA-seq data processing
Sequencing geretourneerd ∼1 miljard paired-end leest van lengte 101 behorende tot 22 embryo’s totaal. Ruwe sequentie data in fastq formaat werden door kwaliteitscontrole om lage-kwaliteit base calls en adapter sequenties (FastX trimmer en clipper) te verwijderen. De gefilterde sequenties werden vervolgens uitgelijnd aan het referentie menselijke genoom (hg18) met de STAR aligner tool67 op een computer. De resulterende .bam-bestanden werden gefilterd op uitlijningskwaliteit, gesorteerd en PCR-duplicaten verwijderd (SAMtools sort en rmdup). Tellingen per gen werden vervolgens berekend met HTSeq-count68 en de uitgelijnde reads werden vergeleken met het humane transcriptoom.
Om rekening te houden met mogelijke batch-effecten als gevolg van biologische variatie tussen patiënten, verschillende invriesprotocollen, kweekmedia of andere factoren, moesten we bepalen welke embryo’s van welke patiënten afkomstig waren. We analyseerden sequentievarianten in de transcriptomen van elk embryo, en voerden hiërarchische clustering uit op de varianten waarvoor we een goede sequentiedekking hadden (Supplementary Fig. 11). We stelden vast dat van de 22 gesequeneerde embryo’s er 17 ‘sibling’ embryo’s hadden, terwijl 5 de enige embryo’s waren van hun respectievelijke patiënten. We uitgesloten die vijf, en vervolgens gebruik gemaakt van de ComBat functie in de sva69,70 pakket in R om batch-effecten te verwijderen uit de RNA-seq gegevens van de resterende 17 embryo’s. Hoewel het uitsluiten van de vijf embryo’s zonder broers of zussen onze resultaten kan hebben vertekend, zou het onmogelijk zijn geweest om de biologische variatie binnen deze patiënten te schatten met behulp van slechts één monster en daarom moesten we ze uitsluiten. Na verwijdering van deze batch-effecten weerspiegelden onze gegevens verschillen in maternaal overgeërfde transcripten tussen levensvatbare en niet-levensvatbare embryo’s die consistent waren voor alle patiënten. Differentiële expressie analyse werd uitgevoerd op de aangepaste gegevens met behulp van het R-pakket edgeR28. Genen met q-waarden (P-waarden gecorrigeerd met de Benjamini-Hochberg methode) kleiner dan 0.01 werden geclassificeerd als statistisch significant.
Gene ontologie en netwerk analyse
De lijst van DE genen met q-waarden<0.01 werd doorgevoerd in DAVID tool (NCBI), en clustering werd uitgevoerd met ontologie termen gerelateerd aan BPs en moleculaire functies (MFs). Clusters met minstens één term met een aangepaste P waarde<0.05 werden statistisch significant geacht en opgenomen in Tabel 1. Termen binnen elke cluster werden gecombineerd tot een enkele beschrijvende zin en opgenomen in Tabel 1. Verdere gen-ontologie analyse werd uitgevoerd met de goseq en GO.db pakketten in R. Alle gen-ontologie categorieën met ten minste 10 genen werden gerangschikt in volgorde van het percentage genen DE binnen die categorie, en vergeleken met het aandeel van genen DE over alle categorieën.
IPA werd gebruikt om de lijst van DE genen te analyseren, samen met de log-fold verandering tussen levensvatbare en niet-levensvatbare embryo’s. Een kernanalyse werd uitgevoerd om cellulaire processen te vinden waarvan werd voorspeld dat ze significant verhoogd of verlaagd zouden zijn op basis van genexpressieveranderingen, evenals netwerken van genen die als groep werden gereguleerd.
Corticale korrelkleuring
De mechanische parameters van embryo’s van B6 muizen en embryo’s van IVF (van CBA muizen) werden gemeten in het zygote stadium in twee afzonderlijke experimenten. De embryo’s werden geclassificeerd als levensvatbaar of niet-levensvatbaar op basis van hun mechanische parameters, en vervolgens werd ZP verwijderd door de embryo’s kort bloot te stellen aan Tyrode’s oplossing (Sigma), gevolgd door drie wasbeurten in PBS (Invitrogen). Denuded embryo’s werden vervolgens gefixeerd in 4% paraformaldehyde gedurende 20 min bij kamertemperatuur en gekleurd met fluoresceïne-isothiocyanaat-gelabeld Lectine-antilichaam (Sigma) en 4,6-diamidino-2-fenylindool. Een Zeiss LSM510 laser-scanning confocale microscoop werd gebruikt voor visualisatie en beeld capture.
Confocale beeldverwerking
Raw beeld stacks werden geconverteerd naar TIFF-formaat en aangepaste Matlab scripts werden geschreven om beeldparameters te extraheren. Contrast aanpassing werd uitgevoerd op alle beelden in elke stapel om rekening te houden voor het verlies van signaal bij grotere beeldvorming diepte, en een projectie beeld werd berekend voor elke stapel. Het cytoplasma van elke cel werd geïsoleerd door het uitvoeren van automatische dorsen met behulp van de methode van Otsu, Canny edge detection en een cirkel Hough transform om de locatie en grootte van elke cel te detecteren. Een intensiteitsprofiel werd berekend langs een pad rond de omtrek van elke cel, op 95% van de celradius, en met een breedte van 10% van de celradius. De in afbeelding 4 uitgezette parameters waren (a) het gemiddelde en (b) de s.d. van dit intensiteitsprofiel. De onderzoeker was geblindeerd voor de mechanische parameters en de groep van elk embryo (in het geval van de micro-injectie-experimenten) tijdens het meten van de corticale korrelparameters.
Statistische tests
Een χ2-test werd gebruikt om te testen of het aandeel embryo’s dat resulteerde in een levende geboorte (paragraaf 2.2) significant verschilde tussen de drie experimentele groepen (voorspeld levensvatbaar op basis van de mechanica, voorspeld niet-levensvatbaar op basis van de mechanica en controle-gesorteerd alleen op morfologie). De enige veronderstelling die bij deze test wordt gemaakt, is dat geen enkele groep (een “groep” verwijst naar hetzij embryo’s die tot een levende geboorte leiden, hetzij embryo’s die niet tot een levende geboorte leiden) minder dan vijf monsters bevat. Aan deze aanname is voldaan voor beide vergelijkingen die zijn uitgevoerd (levensvatbaar versus controle, levensvatbaar versus niet-levensvatbaar).
Om genen te bepalen met significante verschillen in expressie tussen levensvatbare en niet-levensvatbare menselijke embryo’s, zijn de sva- en edgeR-pakketten in R gebruikt. Deze pakketten zijn goed gevalideerd voor gebruik bij het verwijderen van batch-effecten en het bepalen van significante verschillen in expressie voor RNA-seq data.
Een Wilcoxon rank sum test werd gebruikt om corticale korrel helderheid tussen embryo’s vergelijken (een t-test werd niet gebruikt omdat monsters hadden lage aantallen en waren niet normaal verdeeld volgens de Lilliefors test). Om te bepalen of de injectie van het IP3-antilichaam de gemiddelde stijfheid van de embryo’s veranderde, werd een tweezijdige t-test gebruikt omdat de met het antilichaam geïnjecteerde en de met de controle geïnjecteerde groepen normaal verdeeld bleken te zijn volgens de Lilliefors-test. Een tweezijdige Kolmogorov-Smirnov test werd gebruikt om aan te tonen dat de injectie van het antilichaam een significante verandering in de verdeling van de stijfheidswaarden veroorzaakte. Wilcoxon rangsomtests werden gebruikt om verschillen tussen kwartielen van de met antilichamen geïnjecteerde en de met controle geïnjecteerde groepen te vergelijken, omdat er zeer weinig monsters in elk kwartiel waren. Wilcoxon rank sum tests werden ook gebruikt om het verschil te testen in de mediane waarden van de oöcytstijfheid tussen de GV, MI en MII stadia, omdat de stijfheidswaarden niet voldeden aan de criteria voor normaliteit.