Mortaliteit en dysbiose in verschillende darmregio’s tijdens de ontogenese
Mortaliteit van jonge struisvogels trad op tijdens de gehele studieperiode van 12 weken, maar was het hoogst tussen de 4 en 8 weken, met een piek op 6 weken (Fig. 1b). 1b). Zieke individuen volgden de groeicurve van alle andere individuen alvorens snel in gewicht af te nemen voor hun dood (Fig. 1c, d). De oorzaak van de gewichtsvermindering is onbekend, maar zieke dieren aten en dronken niet meer, en leden in sommige gevallen aan diarree, zodat uitdroging en vermagering waarschijnlijk de verklaringen zijn. In totaal stierf 40% van alle kuikens aan vermoedelijke ziekte (68/170, exclusief 60 controles en 4 gewonde individuen). Post-mortems van zieke en controle individuen toonden aan dat sterfte geassocieerd was met uitgebreide ontsteking van het maagdarmkanaal (Fig. 1e; Figuur S1). De darmontsteking scores van zieke individuen (gemiddelde ± SD voor ileum = 3,1 ± 1,0, cecum = 2,0 ± 1,3, colon = 2,0 ± 1,2) waren aanzienlijk hoger dan die van controle individuen (ileum = 0,4 ± 1,0, cecum = 0.04 ± 0,29, dikke darm = 0,08 ± 0,45) (figuur S1).
Mortaliteitspatronen van struisvogels tot de leeftijd van 12 weken. a Eén van de struisvogelkuikens in de studie op de leeftijd van 1 week. b De cumulatieve sterfte en het sterftecijfer per week. c, d Log-getransformeerde gewichten in de tijd van controle-individuen die willekeurig werden geselecteerd voor euthanasie op de weken 2, 4, 6, 8, 10 en 12 (blauwe lijnen in c), en individuen die stierven als gevolg van een vermoedelijke ziekte (rode lijnen in d). Grijze lijnen illustreren de gewichten van alle andere individuen die de hele periode overleefden. e Foto’s tijdens dissectie die wijdverspreide darmontsteking illustreren bij een ziek individu (onder) in vergelijking met een controle individu (boven)
De structuur van de microbiota van zieke en controle individuen was extreem verschillend in alle drie de darmregio’s (Fig. 2, Figuur S2, Tabel 1). In het bijzonder waren er significante verschillen in de microbiële gemeenschapsafstanden (verkregen met zowel Bray-Curtis (BC) als gewogen UniFrac (wUF) maten) tussen zieke en controle individuen, controlerend voor leeftijd, geslacht, groep, en tijd sinds overlijden (Tabel 1). De Bray-Curtis en gewogen UniFrac metingen vertoonden echter contrasterende patronen: Bray-Curtis afstanden waren het grootst in het ileum afnemend naar de lagere darm (cecum-colon), terwijl gewogen UniFrac maten het grootst waren in het colon afnemend naar het ileum (Tabel 1). Geslacht, groep en tijd sinds het overlijden hadden geen significante effecten op de afstandsmetingen van het microbioom in de darmregio’s (tabel 1).
Principal Coordates Analysis (PCoA)-plots van Bray-Curtis-verschillen tussen de microbiomen van controlepersonen (blauw) en zieke personen (rood). Ellipses geven 90%-betrouwbaarheidsintervallen aan
Er werden ook grote verschillen gevonden bij het onderzoeken van de variatie in het microbioom bij zieke individuen versus variatie bij controle-individuen. De zieke individuen leken meer op elkaar in het ileale microbioom dan de controles op elkaar wanneer gebruik werd gemaakt van Bray-Curtis, maar niet van gewogen UniFrac-afstanden (BC Multivariate homogeneity test of group dispersion (betadisper): F1, 99 = 13,9, p = 0,0003. wUF betadisper: F1, 99 = 0,6, p = 0,46) (figuren S3-S4). Daarentegen was het tegenovergestelde het geval in de blindedarm en de dikke darm (BC blindedarm betadisper: F1, 105 = 0,08, p = 0,79. BC colon betadisper: F1, 106 = 1,3, p = 0,25. wUF cecum betadisper: F1, 105 = 11.2, p = 0.001. wUF colon betadisper: F1, 106 = 11,4, p = 0,001) (figuur S3). Samen tonen deze resultaten aan dat de bacteriële samenstelling van zieke en controle individuen het meest verschilde in het ileum, maar dat de dikke darm de meest fylogenetisch verschillende groepen bevatte.
Alfa diversiteit en leeftijdsspecifieke dysbiose in verschillende darmregio’s
De microbiële alfa diversiteit van zieke individuen was sterk verminderd in alle drie de darmregio’s in vergelijking met controles (GLMs ziekte: ileum F1, 99 = 56,7, p = 2,5e-11; cecum F1, 105 = 16,1, p = 0,0001; colon F1, 106 = 61,5, p = 3,9e-12), waarbij werd gecontroleerd voor leeftijd (Fig. 3). In het ileum bleven de verschillen bij alle leeftijden bestaan (GLM ziekte*leeftijd: F1, 97 = 0,0001, p = 0,99), en er waren weinig effecten van leeftijd, zelfs bij gezonde individuen (GLM leeftijd: F1, 98 = 1,4, p = 0,23). In de blindedarm en de dikke darm hadden zieke individuen op vroege leeftijd een lagere alfa diversiteit dan controles (Tabel 1; Fig. 3), maar deze verschillen namen af met de leeftijd naarmate de diversiteit over het algemeen toenam bij alle individuen (GLM ziekte*leeftijd: blindedarm F1, 103 = 10,2, p = 0,002; dikke darm F1, 104 = 9,1, p = 0,003). Verminderingen in alfadiversiteit geassocieerd met ziekte waren dus duidelijk in de gehele darm op vroege leeftijd, maar waren beperkt tot het ileum op oudere leeftijd (zie ook ).
Alfadiversiteit (Shannon-index) tijdens de ontwikkeling in het ileum, de blindedarm en de dikke darm. Controle-individuen worden in blauw weergegeven en zieke individuen in rood. De lijnen geven de lokale regressiecurves weer en de gearceerde gebieden het 95%-betrouwbaarheidsinterval. Het paneel rechtsonder toont alle alfa-diversiteitswaarden samen
Taxa geassocieerd met ziekte in het ileum
Om de microbiële verschillen tussen zieke en controle-individuen beter te begrijpen, evalueerden we de taxonomische samenstelling van alle gastro-intestinale regio’s. Het ileum vertoonde de meest opvallende tekenen van dysbiose (Fig. 4). Controlepersonen hadden een gevarieerde gemeenschap van verschillende bacterieklassen in het ileum, terwijl zieke individuen een bloei vertoonden van Gammaproteobacteria en een belangrijke vermindering van Bacillen en andere zeldzamere klassen. Een gedetailleerd onderzoek van de families die behoren tot de Gammaproteobacteria toonde een bijna volledige dominantie van Enterobacteriaceae in de zieke ileummonsters, terwijl de controle individuen een diverse set van Gammaproteobacteria families herbergden (figuur S5).
De verhouding van bacterieklassen per individu en darmregio, gesorteerd op leeftijd (linker balken = jongste, rechter balken = oudste). Linkerkolom = controle-individuen, rechterkolom = zieke individuen. Bovenste rij = ileum, middelste rij = blindedarm, onderste rij = dikke darm
De Gram-negatieve Enterobacteriaceae is een grote familie die bekend staat om de aanwezigheid van diverse darmpathogenen en pathobionten, en die vaak in hogere concentraties wordt aangetroffen bij gastheren met darmdysbiose. Er waren 19 operationele taxonomische eenheden (OTUs; sequenties met 100% nucleotide identiteit) geassocieerd met Enterobacteriaceae in het ileum, en blast searches tegen de NCBI nucleotide database matchte met een breed scala van genera, waaronder Escherichia, Klebsiella, Shigella, Salmonella, Yokenella, Citrobacter, Enterobacter, Cronobacter, Atlantibacter, Pluralibacter, Leclercia, en Kluyvera. In eerdere studies is aangetoond dat verschillende leden van de Enterobacteriaceae familie vaak gelijktijdig voorkomen en bloeien tijdens dysbiose, wat consistent is met onze resultaten.
Een ander belangrijk kenmerk van dysbiose in het ileum was dat bepaalde individuen microbiomen hadden die bijna volledig bestonden uit Clostridia, een patroon dat niet werd waargenomen bij controle individuen (figuur 4). De families van Clostridia toonden verder opvallende taxonomische patronen bij zieke individuen, met inbegrip van een belangrijke toename van Peptostreptococcaceae en een duidelijke vermindering van Ruminococcaceae en andere zeldzame families (figuur S5). De Peptostreptococcaceae-familie werd in onze gegevens door zes OTU’s vertegenwoordigd, en blast searches leverden matches op met diverse soorten Paeniclostridium, Paraclostridium en Clostridium. De meest voorkomende van deze OTU’s kwam overeen met Paeniclostridium sordellii, een bacterie waarvan bekend is dat er virulente stammen zijn die een hoge morbiditeit en mortaliteit veroorzaken door enteritis en enterotoxaemia bij zowel mens als dier.
Verder identificeerden we specifieke OTU’s die geassocieerd zijn met dysbiose door negatieve binomiale Wald-testen van bacteriële abundanties uit te voeren, terwijl we controleerden voor de leeftijd van de gastheren. Achtendertig OTU’s waren significant oververtegenwoordigd in de ilea van zieke individuen (Fig. 5), waarvan de meeste behoorden tot Clostridia, waaronder Ruminococcaceae, diverse Clostridium spp, en Epulopiscium, maar ook Bacteroides, Escherichia, en Bilophila wadsworthia (Tabel S1).
Differentieel overvloedige OTU’s (q < 0.01) tussen controle- en zieke individuen, afzonderlijk voor de drie darmregio’s. De y-assen geven de taxonomische families aan en de OTU’s zijn op klassenniveau gekleurd. Positieve log2 vouwveranderingen wijzen op een hogere OTU-abundantie bij de controle-individuen en negatieve log2 vouwveranderingen op een hogere abundantie bij de zieke individuen. NA = OTU’s zonder familieclassificatie
Taxa geassocieerd met ziekte in blindedarm en dikke darm
Onderzoek van de relatieve abundanties van bacterieklassen in blindedarm en dikke darm toonde aan dat controle-individuen grotendeels vergelijkbaar waren en een relatief stabiele microbioomsamenstelling vertoonden over gastheren en leeftijden heen. Er waren echter grote verstoringen in de microbiële samenstelling van beide darmregio’s bij zieke individuen (Fig. 4). Net als in het ileum kwamen de Gammaproteobacteriën meer voor in de blindedarm en de dikke darm van zieke individuen, maar een vermindering van Clostridia en een toename van Bacteroidia vormden de meest prominente verschillen. Verdere taxonomische analyses van Bacteroidia toonden aan dat de familie Porphyromonadaceae had proliferated in het cecum en colon van zieke individuen (figuur S5). Deze familie omvatte twee soorten in onze gegevens, Parabacteroides distasonis en Dysgonomonas sp., die gewoonlijk worden aangetroffen in normale darm microbiota. Echter, P. distasonis is eerder geïdentificeerd als een colitis-bevorderende soort in muizen en Dysgonomonas leden zijn bekend te worden geassocieerd met cachexie en intestinale ontsteking .
Differentiële abundantietests identificeerden grote overeenkomsten in de dysbiosepatronen van de blindedarm en de dikke darm, aangezien 50 van de 56 (89%) OTU’s die in de zieke dikke darmmonsters talrijker waren, ook talrijker waren in de zieke blindedarmmonsters (Fig. 5; Tabellen S2-S3). Bovendien waren 15 van deze OTU’s (39%) ook significant oververtegenwoordigd in het ileum (Tabel S1). De meest significante OTU in de blindedarm (q = 1,2e-53) en de dikke darm (q = 2,4e-56) was afwezig bij de controlepersonen, maar overvloedig bij de zieke personen (Tabellen S2-S3). Deze OTU, die ook zeer significant was in het ileum (q = 3,4e-21), had een 100%-match met Clostridium paraputrificum, een bekende menselijke ziekteverwekker die in verband wordt gebracht met sepsis en necrotiserende enterocolitis. C. paraputrificum is ook experimenteel bestudeerd bij gnotobiotische kwartels, waar het laesies en bloedingen veroorzaakte in het darmslijmvlies, geassocieerd met enterocolitis.
Naast C. paraputrificum, vertoonden zeer significante OTU’s die talrijker waren bij zieke individuen (Tabellen S2-S3) een blast-match (99.5-100% identiteit) met de Clostridium-soorten C. colinum, C. cadaveris, C. butyricum, en C. perfringens, die alle eerder in verband zijn gebracht met acute enterocolitis bij zowel struisvogels als andere dieren. Andere OTU’s die sterk oververtegenwoordigd waren in zieke slokdarm- en colonstalen behoorden tot Enterobacteriaceae, Ruminococcaceae, Mogibacteriaceae, Bacteroides, Dorea, Sedimentibacter, Bilophila wadsworthia, en Eggerthella lenta (Fig. 5; Tabellen S2-S3). Veel van deze bacteriën maken deel uit van de normale darmmicrobiota en de meerderheid van alle OTU’s die significant oververtegenwoordigd waren bij zieke individuen waren ook aanwezig bij sommige controle individuen, zij het in veel lagere abundanties (Tabellen S2-S3).
Taxa geassocieerd met gezondheid in verschillende darmregio’s
Het ileum van zieke individuen vertoonde grote reducties in bepaalde bacteriën vergeleken met controles (Fig. 4), voornamelijk Bacillen, een klasse waarin Turicibacteraceae en Lactobacillaceae de meest voorkomende families waren. Turicibacteraceae omvatte twee significante OTU’s van Turicibacter (Tabel S1), die in zieke ilea verlaagde abundanties vertoonden. Het is aangetoond dat Turicibacter zeer erfelijk is bij mensen en muizen waar het in direct contact staat met gastheercellen van de dunne darm. Dit genus is geassocieerd met zowel gezondheid als ziekte, maar wordt vaak gevonden te zijn uitgeput in dieren met diarree en enteropathie.
Een van de meest opvallende verschillen in zowel de blindedarm en dikke darm van de zieke individuen was een aanzienlijke vermindering van de Bacteroidia familie, S24-7 (figuur S5). Er is weinig bekend over S24-7, ondanks het feit dat het een prominente component is van de normale gewervelde darm microbiota. Niettemin hebben studies bij muizen een mogelijk gunstig effect van S24-7 gerapporteerd, waarbij de abundanties vaak verminderd zijn bij zieke gastheren. De meeste OTU’s met verlaagde abundanties in de dikke darm van zieke individuen waren ook ondervertegenwoordigd in de blindedarm (15 van de 19; 79%), wat wijst op een grootschalige depletie van potentieel gezondheidsbevorderende bacteriën in de gehele achterwand. Deze OTU’s behoorden tot taxa als Lachnospiraceae (bijv. Coprococcus, Blautia), Ruminococcaceae (bijv, Ruminococcus), S24-7, Erysipelotrichaceae, Clostridium, Anaeroplasma, Turicibacter, Methanobrevibacter, Akkermansia muciniphila, en verscheidene onbekende Clostridiales (Fig. 5; Tabellen S2-S3).
Terwijl 15 OTU’s significant oververtegenwoordigd bleken in alle drie darmregio’s van zieke individuen, was slechts een enkele OTU significant ondervertegenwoordigd in alle darmregio’s van zieke individuen. Deze OTU kwam overeen met het butyraat-producerende genus Roseburia, dat herhaaldelijk in verband is gebracht met gezondheid. Zo zijn lagere concentraties van Roseburia spp. ontdekt bij mensen met colitis ulcerosa, inflammatoire darmziekten, prikkelbare darm syndroom, obesitas, hepatische encephalopathie, en type 2 diabetes, en bij varkens met varkensdysenterie. Deze resultaten ondersteunen het idee dat Roseburia en vele andere taxa die eerder negatief geassocieerd werden met ziekte, niet alleen specifiek zijn voor zoogdieren dysbiose patronen, maar hun uitputting is een verenigend kenmerk van dysbiose over fylogenetisch ver van elkaar gelegen gastheren zoals mensen en struisvogels.
Disruptie van de darmmicrobiota in de weken voor de dood
Om vast te stellen of dysbiose optreedt vlak voor de dood of het gevolg is van onevenwichtigheden die eerder in het leven zijn ontstaan, onderzochten we de microbiota van ontlastingsmonsters die herhaaldelijk werden verzameld voor de dood. We ontdekten dat de overleving van kuikens tot de leeftijd van 4 weken niet gerelateerd was aan de alfa- of fylogenetische diversiteit van bacteriën eerder in het leven (Tabel S4). De overlevingskans na zes weken werd echter voorspeld door een hogere alfadiversiteit op de leeftijd van 2 weken (Cox hazard ratio (HR): 0,57±0,25, p < 0.05), maar lagere alfa-diversiteit op 4 weken leeftijd (HR: 4,02±0,59, p < 0,05), en lagere fylogenetische diversiteit op twee en vier weken leeftijd (HR 2 weken: 1,40±0,15, p < 0,05; HR 4 weken: 1,88±0,24, p < 0,01) (figuur S6; tabel S4). Deze resultaten suggereren dat individuen met een lage microbiële alfadiversiteit op de leeftijd van 2 weken vatbaar waren voor kolonisatie met verschillende fylogenetische groepen bacteriën, waardoor hun risico op sterfte in de daaropvolgende weken toenam.
Volgende onderzochten we of de abundanties van bacteriefamilies die verschilden tussen zieke en controle individuen patronen van toekomstige sterfte konden voorspellen in de weken voorafgaand aan het overlijden. Er waren slechts zwakke aanwijzingen dat het hebben van hogere abundanties van Lactobacillaceae op 2 weken leeftijd en Turicibacteraceae op 4 weken leeftijd de neiging had om de overleving positief te beïnvloeden (figuur S7; tabel S4). De abundanties van Peptostreptococcaceae en S24-7 na de leeftijd van 6 weken werden ook geassocieerd met een verhoogde latere overleving, hoewel niet significant (tabel S4). Er waren echter zeer sterke associaties tussen de abundanties van Peptostreptococcaceae en S24-7 tijdens de eerste levensweek en sterfte op alle volgende leeftijden, zelfs na controle voor de abundanties van deze bacteriefamilies op latere leeftijden (Peptostreptococcaceae HR range: 1,65±0,13 tot 1,73±0,16, alle p-waarden < 0,001; S24-7 HR-bereik: 1,24±0,11 tot 1,60±0,21, alle p-waarden < 0,05) (Fig. 6; Tabel S4). Dit resultaat suggereert dat de timing van de proliferatie van bepaalde bacteriegroepen, zoals Peptostreptococcaceae en S24-7, de sleutel kan zijn tot de fitness van de gastheer, waarbij hogere abundanties op vroege leeftijden mogelijk nadelige effecten hebben, zelfs als dezelfde bacteriegroepen op latere leeftijden gunstig kunnen zijn. Dit ondersteunt verder het idee dat de eerste dagen na het uitkomen van het ei een kritieke periode zijn die bepaalt of er een verstoring van het microbiële evenwicht optreedt, wat zelfs maanden later nog tot een verhoogde mortaliteit kan leiden.
Besmettingen (genormaliseerd en log-getransformeerd) van twee bacteriefamilies die in verband worden gebracht met ziekte in de weken voorafgaand aan de dood, gemeten door herhaalde ontlastingsbemonstering van individuen. Punten en foutbalkjes zijn gemiddelden ± SE
Milieubronnen van darmbacteriën
Ten slotte evalueerden we potentiële milieubronnen van de microben die aanwezig zijn in de darmen van controle- en zieke individuen. Tijdens de studieperiode werden monsters genomen van water, voedsel en bodemsubstraat, die werden geanalyseerd met SourceTracker . Er was in wezen geen bijdrage van de watervoorziening (0,1-0,4%) of van de bodem (0,2-0,7%) aan de darmmicrobiota van zieke of controle individuen (Fig. 7). In plaats daarvan was het merendeel van de darmbacteriën afkomstig van onbekende bronnen (89,9%). Sommige microbiële sequenties aanwezig in voedsel overlapten met OTU’s gevonden in het ileum en colon. Deze werden echter voornamelijk aangetroffen bij controlepersonen, wat verklaard kan worden doordat gezonde personen meer eten dan zieke personen (Fig. 7). Deze bevindingen wijzen erop dat besmet voedsel of water onwaarschijnlijk bronnen waren van bacteriën die in verband werden gebracht met sterfte.
Milieubronnen van bacteriën aanwezig in de verschillende darmsecties. C = controle-individuen en D = zieke individuen
Onze milieumonsterneming sluit de mogelijkheid niet uit dat er andere milieubronnen van pathogene bacteriën zijn. Zo werden in de buitenverblijven van de kuikens regelmatig verschillende soorten wilde vogels waargenomen, waaronder cape mussen, cape wevers, gemaskerde wevers, rode bisschoppen, en quelea’s. Het bemonsteren van water, voedsel en grond om de 2 weken was misschien ook niet frequent genoeg om mogelijke voorbijgaande aanwezigheid van bacteriën in de omgeving of overdrachten die sporadisch kunnen voorkomen op te sporen. Desalniettemin suggereren onze longitudinale fecale microbiome analyses dat dysbiose problemen vroeg in het leven ontstaan door taxa die al aanwezig zijn in de darm, in plaats van de plotselinge overname van nieuwe taxa. Er is weinig bekend over de microbiomen van eieren, ouders, of de broedomgeving voor deze soort, maar dit is een voor de hand liggende weg voor toekomstig onderzoek dat kan helpen bij het identificeren van manieren om de prevalentie van problematische bacteriën tijdens het vroege leven te controleren. Voor deze studie werden de kuikens afgezonderd van de volwassen dieren opgekweekt omdat dit het beheer en de behandeling vergemakkelijkt. Deze aanpak verhindert echter interacties tussen kuikens en ouders die belangrijk kunnen zijn voor de vroege ontwikkeling van darmmicrobiota. Zo is bijvoorbeeld aangetoond dat coprofagie (zich voeden met uitwerpselen) belangrijk is voor de ontwikkeling van microbiota bij andere dieren en struisvogel kuikens zijn bekend als coprofagisch. Door de kuikens toegang te verschaffen tot volwassen dieren (of ten minste tot hun uitwerpselen) kunnen zij al vroeg in hun leven een evenwichtige en diverse bacteriële gemeenschap opbouwen, waardoor de verspreiding van problematische bacteriën in de toekomst wellicht kan worden voorkomen. Dit idee moet echter nog experimenteel worden getest.