Bacteriën krijgen vorm: Genetic Determinants of E. coli Morphology

OBSERVATION

Bacteriële celvormen vertegenwoordigen miljarden jaren van evolutionaire verfijning. Hun geringe afmetingen resulteren in een hoge oppervlakte/volume-verhouding, die ideaal is voor het transport van voedingsstoffen, een efficiënte ademhaling en het behoud van structurele integriteit. Het is bekend dat de algemene celvorm wordt bepaald door een groot aantal cellulaire processen en omgevingsfactoren (1-3). Het wordt echter al snel een uitdaging om precies te bepalen hoe variaties in vorm de celfunctie beïnvloeden. Gegevens op genoomschaal die genetische bijdragen aan bacteriële morfologie beschrijven zijn een stap in de richting om deze vraag te beantwoorden. Bovendien vertegenwoordigen de resulterende interactienetwerken meerdere gekoppelde biologische netwerken die voortkomen uit verschillende vormfenotypes. Hier beschrijven we een genomische momentopname van Escherichia coli K-12 morfologie in de mid-exponentiële fase met behulp van de Keio deletie collectie (4). We karakteriseren verder genetische interacties tussen deleties invloed vorm en het genoom van E. coli met behulp van high-throughput conjugatie (5, 6).

De high-content imaging platform dat we ontwikkeld is zeer geschikt voor de gecompliceerde taak van bacteriële beeldvorming. Beeldvorming tijden voor hoge dichtheid (384- of 1,536-well) microwell platen kan veel hoger zijn dan de ongeveer 20-min verdubbelingstijd voor E. coli, presenteren temporele uitdagingen voor de beeldvorming genomische bibliotheken binnen een gemeenschappelijke fase van de groei. Verder is de beweeglijkheid van levende bacteriële cellen presenteert extra problemen bij het beperken van de mobiliteit van cellen tijdens microscopische beeldvorming. We tegengegaan deze uitdagingen door gebruik te maken van een glutaaraldehyde fixatief, een gemeenschappelijke eerste stap in elektronenmicroscopie voorbereidingen en bekend om celvorm te behouden met verwaarloosbare effecten op de resolutie van lichtmicroscopie (7). Cellen werden vervolgens negatief gekleurd in glas bodem imaging platen (0,17-mm dikte) met nigrosine en voorzichtig warmte gefixeerd met vochtigheidscontrole, waardoor alle cellen op een gemeenschappelijke brandpuntsvlak. Dit maakte de noodzaak voor fase-contrast, die onwerkbaar was als gevolg van de lichtkegel van de fase annulus wordt geblokkeerd door put randen in 384-well en hogere dichtheid microtiterplaten. Door gebruik te maken van een helder veld kon er meer licht door het monster gaan, wat resulteerde in een snellere belichting en een betere focale nauwkeurigheid. Platen die op deze manier zijn voorbereid, kunnen onbeperkt opnieuw worden belicht en de beeldkwaliteit neemt niet af na verloop van tijd, wat beeldvorming met hoge inhoud mogelijk maakt van monsters die in een specifieke groeifase zijn gefixeerd. De resulterende beelden tonen intense contrast tussen cellen en achtergrond, dat is zeer wenselijk voor kwantitatieve beeldvorming (Fig. 1; volledig gedetailleerd in Tekst S1 en Fig. S1 in het aanvullend materiaal). Tien morfologische kenmerken werden gekwantificeerd per knock-out: oppervlakte, omtrek, minimale ellips-as, minimale lengte Feret, grote ellips-as, grote lengte Feret, circulariteit, rondheid, aspect ratio, en soliditeit. Vervolgens maakten we gebruik van principaal-component analyse (PCA) als een multiparametrische analyse en middel voor dimensionaliteitsreductie (Fig. 1; Fig. S1). Dit gaf ons een volledig onbevooroordeelde manier van fenotypische sortering na acquisitie. Abnormaal gevormde behandelingen werden onthuld door het passen van een ellipsoïde rond de cluster van gegevens die wild-type morfologie in hoofd-component ruimte en het selecteren van die buiten deze cutoff zone vallen. De x, y, en z grenzen van de ellipsoïde in elke dimensie komen overeen met een 3-standaard-afwijking cutoff in de eerste drie hoofdcomponenten.

Op deze manier identificeerden we een 111 deletie mutanten met vormafwijkingen (zie tabel S1 en Data Set S1 in het aanvullend materiaal). Onze aanpak werd gevalideerd door de bevestiging van een aantal bekende vormmutanten, waaronder de tatA deletiemutant, waarvan eerder is aangetoond dat deze lang en geketend is als gevolg van onjuiste lokalisatie van amidases in het periplasma (8). Mutaties in holD, dat codeert voor de DNA polymerase III ψ subeenheid, kunnen bij E. coli leiden tot filamenteuze morfologieën (9). DNA-replicatie heeft inderdaad een synchrone relatie met celdelingsprocessen (10, 11), waarbij verstoringen in DNA-gyrase resulteren in langgerekte cellen met enkele chromosomen en zonder septa (12). Interessant is dat pyridoxine 5′-fosfaat oxidase, gecodeerd door pdxH, pyridoxal 5′-fosfaat (PLP) genereert en een verschuiving veroorzaakte naar lange, af en toe geketende cellen. PLP is een belangrijke cofactor bij de levering van d-alanine en d-glutamaat voor de synthese van peptidoglycaan in de celwand (13), en van pdxH-mutanten is bekend dat ze een filamenteus fenotype hebben (14). Evenzo is EnvC een activator van celwandopbouwende enzymen en is bekend dat het filamenteuze groei veroorzaakt (15), en RodZ is betrokken bij zijwandvorming en is bekend dat het bolvormige morfologie veroorzaakt (16). Deze fenotypes werden allemaal bevestigd in onze screening. Verrassend genoeg coderen 52 genen in onze lijst voor nog niet gekarakteriseerde eiwitten in E. coli, waarbij vele genen verondersteld worden buitenste of cytoplasmatische membraaneiwitten te zijn (Tabel S1). Het beschreven high-content screening platform identificeerde dus niet-essentiële genen die betrokken zijn bij vormbehoud. Om verder te karakteriseren en biologische processen interactie met deze mutaties te sonderen, kozen we voor een genetische interactie array voor te bereiden met een focus op deze vorm genen.

In totaal werden 60 deleties die overeenkomen met de sterkste vormdefecten gekozen als querygenen in een synthetische genetische array, waarvan er 7 niet goed conjugeren met behulp van de methodologie van Côté et al. (17). Dit resulteerde in 53 vormgenen van belang uit Tabel S1 die systematisch werden gekruist (5, 6) met de Keio collectie, waardoor 1.7 × 107 dubbele deletie mutanten werden gegenereerd (zie Data Set S2 in het supplementaire materiaal) en een synthetisch letaal interactienetwerk (zie Fig. S3 in het supplementaire materiaal). We zagen dat mutanten met extremere vormvariaties (bijvoorbeeld pdxH, rodZ, envC, en gpmM mutanten) onder conventionele condities niet goed paren en gedurende langere tijd bij kamertemperatuur moeten paren. Wanneer de genen die ten grondslag liggen aan synthetische letale interacties werden verrijkt met behulp van Gene Ontology (GO) termen voor biologische processen, waren transport en oxidatie-reductieprocessen oververtegenwoordigd (Fig. 2; Fig. S3). Dit was gebaseerd op een histogram van de frequentie van voorkomen voor elke GO term, met ontologieën toegankelijk met behulp van EcoCyc (18) pathway-tools software (19). Interessant is dat het TolC-buitenmembraankanaal met hoge frequentie aanwezig is, wat wijst op een verband tussen de doeltreffendheid van het drug efflux-systeem (Acr, Mdt, Ent, Emr, en Mac) en de celvorm. De voorspelde symporter YdjN, die het vaakst voorkomt, is verder betrokken bij zowel l-cysteïne transport als oxidatieve stress respons (20), biologische processen die toevallig verrijkt zijn in Fig. 2. Inderdaad, genen betrokken bij redox processen waren vaak gekoppeld aan respiratie, zoals in het geval van ytfG, napG, cydB, nrdD, en nrdG. Dit is bijzonder merkwaardig gezien het feit dat de vorm/kromming van het membraan een rol speelt in de functie van membraangeassocieerde eiwitten (21, 22), vooral gezien de mogelijke verbanden tussen de werkzaamheid van geneesmiddelen en de cellulaire ademhaling (23, 24). Er is echter een beperkt inzicht in het verband tussen celvorm (of oppervlakte) en ademhaling. We hebben een opmerkelijk overwicht gezien van interacties van vormgenen met genen die betrokken zijn bij respiratoire functies. In het werk van Côté et al. (17) bijvoorbeeld, werden 82 voedingsstressgenen gekruist met de Keio-collectie en dit resulteerde in minder dan 200 synthetische letale interacties met genen die betrokken zijn bij redoxprocessen, terwijl daarentegen ongeveer 800 dergelijke interacties werden waargenomen voor 53 vormverstorende genen (Fig. 2).

Proberen van de Keio collectie voor gen deleties resulterend in vormafwijkingen leverde onverwacht een schat aan niet gekarakteriseerde genen op. Het verbinden van deze genen met rollen in celvorm kan helpen bij het stroomafwaarts functioneel classificeren, vooral wanneer tegelijkertijd hun genetische interacties worden geprofileerd. In het algemeen lijken genen die betrokken zijn bij vormbehoud inherent verbonden te zijn met biologische processen zoals transport en oxidatie en reductie, maar verder werk is nodig om de aard van de waargenomen interacties te verduidelijken. Van bijzonder belang is de vraag of fysieke verstoringen zoals geometrie van de verpakking of krommingsvariaties (21) gepaard gaan met vormafwijkingen. Niettemin vergroot het hier gepresenteerde onderzoek ons begrip van de gecompliceerde biologie die de vorm van bacteriën bepaalt. Bovendien is de high-content microscopie platform hierin beschreven is zeer aanpasbaar aan een bacteriële genomische of chemische library.