Ihre Entdeckung durch Henry Winkler während einer ihrer ICODA-Theateraufführungen führte schließlich zu ihrem Filmdebüt in Children of a Lesser God (1986). Der Film erhielt allgemein positive Kritiken und Matlins Darstellung als Sarah Norman, eine schwerhörige, taube Frau, die sich in einen hörenden Mann verliebt, wurde hoch gelobt: Richard Schickel vom TIME Magazine schrieb: „Sie hat ein ungewöhnliches Talent, ihre Emotionen – und die des Publikums – in ihren Gebärden zu bündeln. Aber da ist noch etwas mehr, eine ironische Intelligenz, ein grimmiger, aber nicht distanzierender Witz, den das Kino mit seiner berühmten Fähigkeit, Gedanken zu fotografieren, nur in sehr wenigen Aufführungen entdeckt.“ Roger Ebert von der Chicago Sun-Times war ebenfalls von Matlin beeindruckt und schrieb: „Sie behauptet sich gegen das Kraftpaket, mit dem sie spielt, und trägt die Szenen mit einer Leidenschaft und einer fast schmerzhaften Angst davor, zurückgewiesen und verletzt zu werden, worum es bei ihrer Rebellion wirklich geht“, und Paul Attasanio von der Washington Post meinte: „Die offensichtlichste Herausforderung der Rolle ist es, zu kommunizieren, ohne zu sprechen, aber Matlin meistert sie auf dieselbe Weise, wie es die Stars der Stummfilm-Ära taten – sie handelt mit ihren Augen, ihren Gesten.“ Children of a Lesser God brachte ihr einen Golden Globe Award als beste Schauspielerin in einem Drama und einen Academy Award als beste Schauspielerin ein. Mit nur 21 Jahren bleibt Matlin die jüngste Schauspielerin, die den Oscar in der Kategorie Beste Darstellerin erhielt; sie ist immer noch die einzige gehörlose Oscar-Preisträgerin in jeder Kategorie.
Zwei Jahre später hatte sie einen Gastauftritt in der Sesamstraße mit Billy Joel, wo sie eine überarbeitete Version von „Just the Way You Are“ mit Text von Tony Geiss vortrug. Matlin benutzte während des Liedes Zeichensprache und umarmte Oscar den Muffel am Ende des Liedes. Ein Jahr später lud Billy Joel sie ein, in seinem Video zu „We Didn’t Start the Fire“ aufzutreten.
Im Jahr 1989 stellte Matlin eine gehörlose Witwe in dem Fernsehfilm „Bridge to Silence“ dar. In dieser Rolle sprach sie zusätzlich zur Gebärdensprache. Das People Magazine mochte den Film nicht, lobte aber Matlins Arbeit und schrieb: „Die schöne, emotional bewegende Matlin ist zu gut für diesen gut gemeinten, aber sentimentalen Schund.“ Für ihre Arbeit als weibliche Hauptrolle in der Fernsehserie Reasonable Doubts (1991-1993) wurde sie für einen Golden Globe nominiert. Matlin wurde für einen Emmy Award für einen Gastauftritt in Picket Fences (1992) nominiert und wurde während der letzten Staffel (1996) zu einer festen Größe in dieser Serie. 1994 spielte sie Carrie Buck in dem Fernsehdrama Against Her Will: The Carrie Buck Story, basierend auf dem Fall Buck v. Bell 274 U.S. 200 von 1927 des Obersten Gerichtshofs der Vereinigten Staaten. In dieser Rolle stellte Matlin zum ersten Mal in ihrer Karriere eine hörende Frau dar, was ihr eine CableACE-Nominierung als beste Schauspielerin einbrachte. Sie hatte eine prominente Nebenrolle in dem Drama It’s My Party (1996).
Matlin hatte später wiederkehrende Rollen in The West Wing, und Blue’s Clues. Andere Fernsehauftritte umfassen Seinfeld („The Lip Reader“), The Outer Limits („The Message“), ER, The Practice und Law & Order: Special Victims Unit. Sie wurde für Primetime Emmy Awards nominiert für ihre Gastauftritte in Seinfeld, Law & Order: Special Victims Unit, und The Practice.
Ted Koppel spricht mit Gregory Hlibok, Elizabeth Zinser und Marlee Matlin in ABC’s Nightline am 9. März 1988, Youtube video
Im Jahr 2002 veröffentlichte Matlin ihren ersten Roman mit dem Titel Deaf Child Crossing, der lose auf ihrer eigenen Kindheit basiert. Später schrieb und veröffentlichte sie eine Fortsetzung mit dem Titel Nobody’s Perfect, die im Oktober 2007 auf der Bühne des John F. Kennedy Center for Performing Arts in Zusammenarbeit mit VSA Arts aufgeführt wurde. 2004 spielte sie die Hauptrolle in dem Film What the Bleep Do We Know? als Amanda. Ebenfalls 2003 moderierte sie das 3rd Annual Festival for Cinema of the Deaf in Chicago.
2006 spielte sie ein gehörloses Elternteil in Desperate Housewives. Sie hatte eine wiederkehrende Rolle in My Name Is Earl als Pflichtverteidigerin von Joy Turner (die viele Witze über Matlins Gehörlosigkeit auf Matlins Kosten machte) und spielte die Mutter eines der Opfer in einer Episode von CSI: NY. Im selben Jahr wurde Matlin in Staffel 4 von The L Word als Jodi Lerner, eine lesbische Bildhauerin, besetzt. Sie erschien in Staffel 4 (2007), Staffel 5 (2008) und Staffel 6 (2009) als die Freundin einer der Protagonisten der Serie, Bette Porter, gespielt von Jennifer Beals.
Am 4. Februar 2007 und am 7. Februar 2016 interpretierte Matlin das „Star Spangled Banner“ in amerikanischer Zeichensprache beim Super Bowl XLI in Miami, Florida, bzw. beim Super Bowl 50 in Santa Clara, Kalifornien. Im Januar 2008 trat sie in der Fernsehserie Nip/Tuck auf.
Im Jahr 2008 nahm Matlin als Teilnehmerin an der sechsten Staffel von ABCs Dancing with the Stars teil. Ihr Tanzpartner war der Newcomer Fabian Sanchez. Matlin und Sanchez waren das sechste Paar, das aus dem Wettbewerb ausschied.
Am 6. Mai 2009 erhielt Matlin einen Stern auf dem Hollywood Walk of Fame.
Am 8. November 2009 trat Matlin in Seth & Alex’s Almost Live Comedy Show auf, moderiert von Seth MacFarlane und Alex Borstein. Nachdem Borstein Matlin imitierte, wie sie MovieFone anrief und „Poker Face“ sang, erschien Matlin selbst und startete eine komische Tirade gegen Borstein, weil er sich über sie lustig machte und sie nicht eingeladen wurde, ihre eigene Stimme für Family Guy zur Verfügung zu stellen. Matlin übernahm die Stimme von Stella, Peter Griffins Mitarbeiterin, in der Episode „The Blind Side“ aus Staffel 10; Stella wurde später zu einer wiederkehrenden Figur.
Im Jahr 2010 produzierte Matlin einen Pilotfilm für eine Reality-Show mit dem Titel „My Deaf Family“, den sie verschiedenen nationalen Sendern vorstellte. Obwohl sie Interesse bekundeten, kaufte kein Sender die Rechte an der Show. Am 29. März 2010 lud Matlin den Pilotfilm auf YouTube hoch und startete eine virale Marketing-Kampagne.
Am 26. Juli 2010 hielt Matlin eine Rede auf einer Veranstaltung zum 20. Jahrestag des Americans with Disabilities Act.
Im folgenden Jahr war Matlin Finalistin in der NBC-Show The Celebrity Apprentice und kämpfte um Geld für ihre Wohltätigkeitsorganisation The Starkey Hearing Foundation, wobei sie den zweiten Platz belegte. In einer Folge von The Celebrity Apprentice, „The Art of the Deal“, die am 3. April 2011 ausgestrahlt wurde, sammelte sie jedoch mehr Geld für wohltätige Zwecke, als jemals zuvor in einer Fernsehshow in einem einzigen Event gesammelt worden war: 986.000 Dollar. Donald Trump, der damals „The Celebrity Apprentice“ moderierte, spendete daraufhin zusätzlich 14.000 Dollar, so dass die Spende eine glatte Million betrug.
Im Jahr 2013 spielte Matlin sich selbst in „No Ordinary Hero: The SuperDeafy Movie“. Ab Januar 2015 fungierte Matlin auch als „Celebrity Ambassador“ der ACLU für Behindertenrechte.
Als „Celebrity Ambassador“ für die ACLU versuchte Matlin, die Kluft zwischen der Strafverfolgung und der Gehörlosengemeinschaft zu überbrücken, indem sie die Kommunikationsbarrieren diskutierte, wenn Gehörlose von der Polizei angehalten werden.
Matlin spielte die wiederkehrende Figur der Melody Bledsoe in Switched at Birth. Im September 2015 gab sie ihr Broadway-Debüt in der Revival-Produktion des Musicals Spring Awakening.
Anfang 2017 spielte Matlin die wiederkehrende Rolle der Harriet in der Syfy-Fernsehserie The Magicians.
Am 31. Juli 2017 wurde von Deadline bekannt gegeben, dass Matlin als Serienmitglied in der dritten Staffel des ABC-Thrillers Quantico dabei ist. Sie spielte die Rolle der Ex-FBI-Agentin Jocelyn Turner.
Im Jahr 2019 wurde Marlee Matlin in einem Artikel von Hearing Like Me als jemand erwähnt, der mehr #DeafTalent in „Life and Deaf“ bringen könnte, einer neuen Comedy-Show, die das Leben eines Kindes mit gehörlosen Eltern erforschen soll. In der neuen Serie, die in den 1970er Jahren spielt, wird die preisgekrönte Schauspielerin und Gehörlosen-Aktivistin Marlee Matlin die Hauptrolle spielen. Die Show soll laut Deadline von Marlee Matlin exekutiv produziert werden.