Wir haben alle schon von der Zentrifugation gehört, oder genauer gesagt, von den Horrorgeschichten, die damit verbunden sind, wenn eine Zentrifugation schief geht, wie im Fall des berühmten Cornell-Zentrifugationsunfalls. Die meisten Fehler bei der Zentrifugation sind auf eine schlechte Handhabung durch den Anwender zurückzuführen. Daher ist es entscheidend zu verstehen, warum wir bei der Zentrifugation tun, was wir tun, um Schäden an der Maschine und am Personal zu vermeiden. Hier habe ich einige der häufigsten Probleme aufgelistet, die bei der Zentrifugation leicht übersehen werden können, und warum sie so wichtig für die richtige Handhabung einer Zentrifuge sind.
Es geht um das Gleichgewicht
Bei der Zentrifugation werden Zentrifugalkräfte erzeugt, um die Probenbestandteile aufgrund ihrer Größe und Dichte effektiv zu trennen. Kleine Unwuchten können abnormale Vibrationen verursachen, die den Rotor beschädigen können. Eine unwuchtige Zentrifuge ist so gefährlich wie eine instabile chemische Reaktion. Sie kann nicht nur das Gerät beschädigen, sondern auch einen Dominoeffekt von Katastrophen auslösen – vom Geräteausfall über Probenbruch, der potenziell schädliche Verunreinigungen in die Umwelt freisetzen kann (infektiöse Proben, schädliche Aerosole etc.), bis hin zu Verletzungen des Anwenders, was insgesamt zu einer großflächigen Zerstörung führt und ein großes Sicherheitsrisiko darstellt.
A) Die Notwendigkeit des präzisen Auswuchtens bei hohen Geschwindigkeiten
Präzises Auswuchten ist bei Hochgeschwindigkeitszentrifugationen entscheidend. Um dies besser zu verstehen, müssen wir auf einige grundlegende physikalische Konzepte zurückgreifen. Nach dem zweiten Newtonschen Gesetz ist die Kraft (F) gleich der Masse (M) mal der Beschleunigung (A). Somit ist die Zentrifugalkraft, die bei der Zentrifugation entsteht, direkt proportional zur Probenmasse und zur Beschleunigung. Bei einer Kreisbewegung ist die Beschleunigung abhängig von der Drehzahl und dem Radius des Rotors. Bei hohen Drehzahlen können schon geringe Schwankungen der Probenmasse zu einem erheblichen Kraftungleichgewicht führen, was katastrophale Folgen haben kann.
B) Auswuchten nach Rotortyp
Unabhängig davon, ob die Zentrifuge einen Festwinkel- oder einen Ausschwingrotor hat, sind zwei wichtige Faktoren beim Auswuchten zu beachten: das Probenvolumen und die symmetrische Anordnung der Gefäße. Es ist darauf zu achten, dass die Probenvolumina in allen Gefäßen gleich sind und die Gefäße direkt gegenüber in der Zentrifuge platziert werden. Bei einer ungeraden Anzahl von Röhrchen gleichen Sie diese aus, indem Sie ein zusätzliches, mit Wasser gefülltes Röhrchen mit dem gleichen Volumen wie die Versuchsröhrchen hinzufügen. Wenn die Lösungen nicht von ähnlicher Dichte sind (z. B. Aceton und Wasser), sollten die Röhrchen die gleiche Masse und nicht das gleiche Volumen haben, um korrekt ausgeglichen zu werden. Bei Ausschwingrotoren ist zusätzlich darauf zu achten, dass alle Schlitze geeignete Rotorbecher mit gleichem Gewicht enthalten.
2. RCF vs. RPM und warum es darauf ankommt
RCF (relative Zentrifugalkraft oder g-Kraft) und RPM (Umdrehungen pro Minute) werden üblicherweise zur Beschreibung der Zentrifugalgeschwindigkeit verwendet. Diese Einheiten sind jedoch völlig unterschiedlich. RPM bezeichnet die Rotationsgeschwindigkeit, die vom Rotorradius abhängt. RCF bezeichnet die Zentrifugalkraft auf die Proben und berücksichtigt sowohl den Rotorradius als auch die Rotationsgeschwindigkeit. Bei Zentrifugen mit unterschiedlichen Rotorgrößen kann durch entsprechende Anpassung der RPM die gleiche RCF erreicht werden. Dies macht die RCF zur bevorzugten Einheit für die Beschreibung von Zentrifugalgeschwindigkeiten, da sie über Zentrifugen hinweg verglichen werden kann, während die Drehzahl nur für Zentrifugen mit demselben Rotorradius konstant ist. Einfach ausgedrückt: RPM ist nicht gleich RCF, und die Drehzahlangaben von RPM müssen in RCF umgerechnet werden, um sicherzustellen, dass die richtige Zentrifugalkraft angewendet wird.
3. Zeit, Geschwindigkeit und Zentrifugation
Die Wahl der Zentrifugationsgeschwindigkeit hängt von der Größe und Zerbrechlichkeit der Partikel in der Probe ab. Je kleiner die Partikelgröße ist, desto höher ist die Zentrifugationsgeschwindigkeit. Zum Beispiel werden Bakterienzellen bei höheren Geschwindigkeiten (2000-10.000 x g) pelletiert als Säugetierzellen (500-2000 x g). Außerdem können niedrigere Zentrifugationsgeschwindigkeiten bei fragileren Proben verwendet werden.
Ein weiterer kritischer Faktor, der die Effizienz der Trennung beeinflusst, ist die RCF. Die RCF ist proportional zum Radius des Rotors und zum Quadrat der Drehzahl. Aufgrund dieser quadratischen Abhängigkeit der RCF von der Drehzahl sind Zentrifugationsgeschwindigkeiten von 1000 RPM für 5 Minuten und 500 RPM für 10 Minuten nicht austauschbar. Erstere erzeugt eine viel größere RCF als letztere. Daher ist es wichtig, die RCF zu berücksichtigen, wenn Sie die Geschwindigkeit und die Zeit für Ihre Zentrifugation bestimmen.
4. Zentrifugation bei unterschiedlichen Temperaturen
Die Zentrifugation erzeugt Wärme, die die Temperatur innerhalb einer Zentrifuge erhöhen kann (manchmal um mehr als 15°C). Dies kann die Stabilität von temperaturempfindlichen Proben beeinträchtigen. In solchen Fällen werden meist gekühlte Zentrifugen bevorzugt. Konstante Temperaturen können aber auch in einer Raumzentrifuge gehalten werden. Die Probentemperatur während der Zentrifugation wird hauptsächlich von drei Faktoren beeinflusst: Rotormaterial, Rotorform und Rotationsgeschwindigkeit.
A) Rotormaterial
Die Temperatur kann während der Zentrifugation durch die Wärmeleitfähigkeit des Rotormaterials beeinflusst werden. Rotoren aus Metall, wie Stahl und Aluminium, haben eine hohe Dichte und eine hohe Wärmeleitfähigkeit. Sie leiten Wärme effizient weiter und kühlen schnell ab. Im Gegensatz dazu sind Materialien wie Polymere und Kohlefasern Wärmeisolatoren und halten die Temperatur konstant.
B) Rotorform
Die Form des Rotors bestimmt den Luftstrom innerhalb einer Zentrifuge, ähnlich wie die Schaufeln eines elektrischen Ventilators den Luftstrom in und aus der Maschine beeinflussen. Die Optimierung des Luftstroms innerhalb einer Zentrifuge durch die Rotorform ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Temperatur.
C) Drehzahl
Die Drehzahl ist direkt proportional zum Temperaturanstieg – bei höheren Drehzahlen wird mehr Wärme erzeugt. Es ist wichtig, die maximale Drehzahl der Zentrifuge und den Bereich der Drehzahlen zu kennen, der einen Temperaturbereich einhält, der das Ergebnis des Experiments nicht verändert. Normalerweise werden diese Informationen vom Hersteller in der Bedienungsanleitung des Geräts bereitgestellt, um dem Benutzer zu helfen, die Einschränkungen zu verstehen und zu umgehen.
5. Bremsen oder nicht bremsen
Bei der Zentrifugation wird die Trennung der Probenbestandteile während der Abbremsphase fortgesetzt. Viele Zentrifugen bieten die Möglichkeit, die Verzögerungseinstellungen (Bremsen) zu steuern, um die Zentrifuge schneller zum Stillstand zu bringen, aber wann braucht man diese Option wirklich, und wie wirkt sie sich auf die Probenergebnisse aus?
Bremsen kann besonders bei Zentrifugationen mit Nukleinsäureextraktionen oder der Pelletierung von Bakterienzellen sinnvoll sein, die durch plötzliches Anhalten nicht beeinträchtigt werden. Bei Experimenten, die empfindlicher auf abruptes Abbremsen reagieren, wie z. B. die Isolierung von peripheren mononukleären Blutzellen und Gradientenzentrifugationen, kann das Abbremsen jedoch dazu führen, dass sich getrennte Schichten wieder vermischen. In solchen Fällen ist es besser, die Bremse auszuschalten, damit die Verzögerung allmählich erfolgt und die Gradienten nicht stört. Einige Zentrifugen bieten eine Reihe von Verzögerungseinstellungen. Dies kann beim Schleudern von Säugetierzellen nützlich sein, die empfindlich auf plötzliche Verlangsamungen reagieren, aber gleichzeitig eine gewisse Verzögerung benötigen, um die Zeit zu minimieren, die die Zentrifuge braucht, um zum Stillstand zu kommen.
6. Wo ist das Pellet?
Eine der häufigsten Anwendungen der Zentrifugation ist das Pelletieren von Proben, wie z. B. Bakterienzellen, Säugetierzellen oder Nukleinsäuren. Bei der Verwendung eines Festwinkelrotors bestimmt der Winkel des Rotors die Position des Pellets. Um sicherzustellen, dass Sie immer wissen, wo sich Ihr Pellet befindet, ist es eine gute Laborpraxis, die Röhrchen immer mit den Deckelscharnieren in der gleichen Ausrichtung zu drehen (z. B. Deckelscharniere nach außen). Dies ist besonders nützlich, um Probenverluste während der DNA-Extraktion zu vermeiden, wenn das Pellet nach dem Ethanol-Waschschritt fast unsichtbar ist. Bei Ausschwingrotoren bilden sich die Pellets meist am Boden des Gefäßes.
Insgesamt hoffe ich, dass die Lektüre dieses Artikels Ihnen hilft, bequemer und sicherer mit Zentrifugen zu arbeiten. Wenn Sie ein Zentrifugen-Desaster erlebt oder miterlebt haben, teilen Sie Ihre Geschichte sowie Tipps und Tricks für ein glückliches Schleudern gerne in den Kommentaren unten mit. Möge die Macht mit Ihnen sein!
- Eppendorf. Centrifuge Safety.
- Eppendorf. Thermal Conductivity.
- Sigma. Probentemperatur während einer Hochdurchsatz-Zentrifugation bei Umgebungstemperatur mit Sigma 4-5L.
- Owen Mitch Griffith. Probenvermischung während Dichtegradiententrennungen mit Thermo Scientific Fiberlite F21-8x50y mL Festwinkelrotor.
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