ダチョウの幼少期の死亡率につながる幼少期の腸内環境の変化

病気の人のマイクロバイオームの変動と、対照の人の変動を比較すると、大きな違いが見られました。 Bray-Curtis距離ではなく、加重UniFrac距離を用いた場合、疾患者は対照者よりも回腸のマイクロバイオームにおいて互いに似ていました（BC Multivariate homogeneity test of group dispersion (betadisper)）。 F1, 99 = 13.9, p = 0.0003. WUF betadisper: F1, 99 = 0.6, p = 0.46）であった（図S3〜S4）。 一方、盲腸と結腸ではその逆であった（BC盲腸betadisper: F1, 105 = 0.08, p = 0.79. BC colon betadisper: F1, 106 = 1.3, p = 0.25. WUF盲腸ベタディスパー。 F1, 105 = 11.2, p = 0.001. WUF colon betadisper: F1, 106 = 11.4, p = 0.001）であった（図S3）。 これらの結果を総合すると、疾患者と対照者の細菌組成は回腸で最も異なっていたが、大腸では系統的に異なるグループが最も多く含まれていた。

異なる腸管領域におけるα多様性と年齢特異的な生育異常

病気の人の微生物のα多様性は、年齢をコントロールした上で、3つの腸管領域すべてでコントロールと比較して大幅に減少していた（GLMs disease: ileum F1, 99 = 56.7, p = 2.5e-11; cecum F1, 105 = 16.1, p = 0.0001; colon F1, 106 = 61.5, p = 3.9e-12）（図3）。 回腸では、すべての年齢で差が持続し（GLM disease*age: F1, 97 = 0.0001, p = 0.99）、健康な人でも年齢の影響はほとんど見られなかった（GLM age: F1, 98 = 1.4, p = 0.23）。 盲腸と結腸では、疾患者は対照者に比べて早期からα線の多様性が低かったが（表1、図3）、これらの差は年齢とともに小さくなり、すべての個体で多様性が増加した（GLM疾患*年齢：盲腸F1, 103 = 10.2, p = 0.002; 結腸F1, 104 = 9.1, p = 0.003）。 このように、疾患に伴うα多様性の減少は、早い年齢では腸全体に見られるが、年齢が高くなると回腸に限定されることがわかった。

回腸、盲腸、結腸における発育期のα多様性（シャノン指数）を示す。 対照個体を青で、疾患個体を赤で示した。 線はフィットした局所回帰平滑化曲線を、斜線部分は95%信頼区間を示す。 右下のパネルは、すべてのアルファ多様性の値をまとめて表示しています

回腸の疾患に関連する分類

疾患者と対照者の間の微生物の異質性をよりよく理解するために、すべての消化管領域の分類学的組成を評価しました。 その結果、最も顕著な微生物異常が見られたのは回腸でした（図4）。 対照群では、回腸にさまざまなクラスの細菌が混在していたが、疾患群では、ガンマープロテオバクテリアが増加し、バチルスやその他の希少なクラスの細菌が大幅に減少していた。 Gammaproteobacteriaに属する科を詳細に調べたところ、疾患のある回腸サンプルではEnterobacteriaceaeがほぼ完全に優勢であるのに対し、対照個体ではGammaproteobacteriaの多様な科が存在していた（図S5）。

個体および腸管領域ごとの細菌クラスの割合を、年齢でソートしたもの（左のバー＝最年少、右のバー＝最年長）。 左列＝コントロール個体、右列＝疾患個体。 上段＝回腸、中段＝盲腸、下段＝結腸

グラム陰性のEnterobacteriaceaeは、いくつかの腸の病原体や病因を包含することでよく知られている大きな科であり、腸内環境が悪化した宿主では頻繁に高い頻度で見られる。 回腸においてEnterobacteriaceaeに関連する19のOperative Taxonomic Unit（OTU：ヌクレオチド同一性100％の配列）が存在し、NCBIのヌクレオチドデータベースとのブラスト検索では、Escherichia、Klebsiella、Shigella、Salmonella、Ykenella、Citrobacter、Enterobacter、Cronobacter、Atlantibacter、Pluralibacter、Leclercia、Kluyveraなどの幅広い属に一致した。

回腸のバイオシスのもう一つの特徴は、特定の人のマイクロバイオームがほとんどクロストリジウムで構成されていることで、これは対照群には見られないパターンです（図4）。 クロストリジウム科は、疾患者において、ペプトストレプトコッカス科が大幅に増加し、ルミノコッカス科やその他の希少な科が著しく減少するなど、さらに顕著な分類学的パターンを示した（図S5）。 Peptostreptococcaceaeは6つのOTUで構成されており，ブラスト検索では，Paeniclostridium，Paraclostridium，Clostridiumのさまざまな種にマッチした．

次に、宿主の年齢をコントロールしながら、細菌量の負の二項Wald検定を行うことで、微生物の異常に関連する特定のOTUを特定しました。 その結果、38のOTUが病気の人の回腸で有意に過剰発現していた（図5）。

Differentially rich OTU（q < 0.Y軸は分類学上のファミリーを示し、OTUはクラスレベルで色付けされている。 正のlog2 fold変化は、対照個体でOTUの存在量が多いことを示し、負のlog2 fold変化は、疾患個体で存在量が多いことを示す。 NA = ファミリー分類のないOTU

盲腸・結腸における疾患に関連する分類

盲腸・結腸における細菌クラスの相対的な存在感を調べたところ、対照個体はほぼ同様で、宿主や年齢を問わず比較的安定したマイクロバイオーム組成を示していた。 しかし、病気の人では、両腸の微生物組成に大きな変化が見られた（図4）。 盲腸と結腸では、回腸と同様にガンマープロテオバクテリアが多く見られたが、最も顕著な違いはクロストリジウムの減少とバクテロイデスの増加であった。 Bacteroidiaをさらに分類学的に分析すると、Porphyromonadaceae科が疾患者の盲腸や大腸で増殖していた（図S5）。 この科には、我々のデータではParabacteroides distasonisとDysgonomonas sp.の2種が含まれており、これらは通常の腸内細菌叢によく見られる種である。 しかし、P. distasonisはマウスの大腸炎を促進する種として同定されており、Dysgonomonasのメンバーは悪液質や腸の炎症に関連していることが知られています。

存在量の差を調べることで、盲腸と大腸のバイオシスパターンには大きな共通点があることがわかった。大腸の疾患サンプルで存在量が多かった56のOTUのうち50 (89%) が、盲腸の疾患サンプルでも存在量が多かったのである (Fig. 5; Tables S2-S3)。 さらに、これらのOTUのうち15個（39％）は、回腸においても有意に多く含まれていた（表S1）。 盲腸（q = 1.2e-53）および結腸（q = 2.4e-56）で最も有意なOTUは、対照群では存在しなかったが、疾患群では豊富に存在した（表S2-S3）。 このOTUは、回腸でも高い確率で検出され（q = 3.4e-21）、敗血症や壊死性腸炎を引き起こす病原体として知られるClostridium paraputrificumと100％一致した。

C. paraputrificum以外にも、病気の個体に多く含まれる重要なOTU（表S2-S3）は、C. paraputrificumとブラストマッチ（99.C. paraputrificum以外にも、罹患個体に多く含まれる重要なOTU（表S2-S3）は、ダチョウや他の動物の急性腸炎との関連が指摘されているClostridium種のC. colinum、C. cadaveris、C. butyricum、C. perfringensとブラストマッチ（99.5-100%同一）した。 疾患のある盲腸や結腸のサンプルに多く含まれたその他のOTUは、Enterobacteriaceae、Ruminococcaceae、Mogibacteriaceae、Bacteroides、Dorea、Sedimentibacter、Bilophila wadsworthia、Eggerthella lentaに属するものであった（図5、表S2-S3）。 これらの細菌の多くは、正常な腸内細菌叢の一部を構成しており、病気の人で有意に過剰発現しているすべてのOTUの大部分は、はるかに低い存在量ではあるが、いくつかの対照群にも存在していた（表S2-S3）。

腸内の各部位における健康に関連する分類

疾患者の回腸では、対照群と比較して特定の細菌が大幅に減少していた（図4）。その主なものはBacilliで、TuricibacteraceaeとLactobacillaceaeが最も多い科であった。 Turicibacteraceaeには、疾患のある回腸で存在量が減少したTuricibacterの2つの有意なOTUが含まれていた（Table S1）。 Turicibacterは、小腸の宿主細胞と直接接触しているヒトやマウスで高い遺伝性を示すことが明らかになっている 。

病気の人の盲腸と大腸の両方で最も顕著な違いは、バクテロイデス科のS24-7が大幅に減少していることでした（図S5）。 S24-7は、正常な脊椎動物の腸内細菌叢の重要な構成要素であるにもかかわらず、ほとんど知られていない。 しかし、マウスを用いた研究では、病気の宿主ではS24-7の存在がしばしば減少し、有益な効果があることが報告されている。 罹患者の大腸で存在量が減少したOTUの大半は盲腸でも存在量が減少しており（19個中15個、79％）、後腸全体で健康に関連する可能性のある細菌が大規模に枯渇していることがわかった。 これらのOTUは、Lachnospiraceae（Coprococcus、Blautiaなど）、Ruminococcaceae（Ruminococcusなど）、Sycophobiaなどの分類群に属していた。

15のOTUが疾患者の3つの腸管領域すべてで有意に過剰発現していることが判明した一方で、1つのOTUだけが疾患者のすべての腸管領域で有意に過小発現していた。 このOTUは、酪酸を産生するRoseburia属に一致し、健康との関連が繰り返し指摘されている。 例えば、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、肥満、肝性脳症、2型糖尿病の人や、豚の赤痢の豚では、Roseburia属の存在量が少ないことが発見されている。 これらの結果は、Roseburiaをはじめ、これまで病気との関連性が指摘されてきた多くの分類群が、哺乳類のバイオシスのパターンに特異的なものであるだけでなく、それらの枯渇が、ヒトやダチョウなどの系統的に離れた宿主のバイオシスに共通する特徴であるという考えを支持するものです。

死の直前の数週間における腸内細菌叢の破壊

死の直前に細菌叢の異常が起こるのか、それとも生前に生じた不均衡が原因なのかを明らかにするために、死の直前に繰り返し採取した糞便サンプルの細菌叢を調べました。 その結果、生後4週間までのヒナの生存率は、生前の細菌のαや系統的な多様性とは関係ないことがわかった（Table S4）。 しかし、6週齢以降の生存確率は、生後2週齢でのアルファ多様性が高いほど予測された（Coxのハザード比（HR）：0.57±0.25、p < 0.05）、しかし、4週齢ではアルファの多様性が低く（HR: 4.02±0.59, p < 0.05）、2週齢と4週齢では系統的な多様性が低く（HR 2 weeks: 1.40±0.15, p < 0.05; HR 4 weeks: 1.88±0.24, p < 0.01）（図S6；表S4）。

次に、疾患者と対照者の間で異なる細菌群の存在量が、死に至るまでの数週間における将来の死亡率のパターンを予測できるかどうかを調べました。 その結果、2週齢ではLactobacillaceae、4週齢ではTuricibacteraceaeの存在量が多いことが、生存率にプラスの影響を与える傾向があるという弱い証拠しか得られなかった（図S7；表S4）。 また、6週齢以降のPeptostreptococcaceaeとS24-7の存在量も、有意ではないが、その後の生存率の増加と関連していた（表S4）。 しかし、生後1週間のPeptostreptococcaceaeおよびS24-7の存在量と、その後のすべての年齢での死亡率との間には、それ以降の年齢でのこれらの細菌群の存在量をコントロールした後でも、非常に強い関連性が見られた（Peptostreptococcaceae HR range: 1.65±0.13～1.73±0.16、いずれもp値 < 0.001; S24-7 HR range: 1.24±0.11から1.60±0.21、すべてのp値 < 0.05）（図6；表S4）。 この結果は、PeptostreptococcaceaeやS24-7などの特定の細菌群が増殖するタイミングが宿主のフィットネスに重要であることを示唆しており、同じ細菌群が遅い年齢では有益であっても、早い年齢では有害な影響を与える可能性がある。

個体の繰り返しの糞便サンプリングにより測定した、死亡前の数週間の疾患に関連する2つの細菌群の存在量（正規化および対数変換）。 点とエラーバーは平均値±SEを表す

腸内細菌の環境的供給源

最後に、対照群と疾患群の腸内に存在する微生物の潜在的な環境的供給源を評価した。 研究期間中に水、食品、土壌からサンプルを採取し、SourceTrackerで分析しました。 疾患者および対照者の腸内細菌叢には、水道（0.1〜0.4％）および土壌（0.2〜0.7％）からの寄与は基本的に見られなかった（図7）。 代わりに、腸内細菌の大部分は未知の供給源からのものであった（89.9％）。 食品に含まれる微生物の配列の中には、回腸や大腸で見つかったOTUと重なるものがあった。 しかし、これらは対照者に多く見られた。これは、健康な人が病気の人よりも多く食べていることで説明できるかもしれない（図7）。

異なる腸管セクションに存在する細菌の環境的供給源。 C = 対照個体、D = 罹患個体

私たちの環境サンプリングスキームは、病原性細菌の他の環境源がある可能性を排除するものではありません。 例えば、ケープスズメ、ケープウィーバー、マスクウィーバー、レッドビショップ、ケレアなどの数種の野鳥がヒナの屋外の囲いの中で頻繁に観察されました。 また，水，餌，土壌を2週間ごとに採取しても，環境中の一時的な細菌の存在や，散発的に発生する可能性のある感染現象を検出するには十分な頻度ではなかったかもしれない。 とはいえ、我々の縦断的な糞便マイクロバイオーム解析は、新たな分類群を突然獲得するのではなく、腸内にすでに存在する分類群から、生後早期に異生物問題が生じることを示唆している。 この種の卵、親、孵化環境のマイクロバイオームについてはほとんど知られていないが、これは、生後間もない時期に問題のある細菌の蔓延を抑制する方法を特定するのに役立つ、今後の研究のための明らかな手段である。 この研究では、管理や取り扱いが容易なことから、ヒナを成体から隔離して飼育した。 しかし、この方法では、腸内細菌叢の早期確立に重要と思われるヒナと親の間の相互作用が妨げられてしまう。 例えば、共食い（糞を食べること）は他の動物の微生物叢の形成に重要であることが示されており、ダチョウのヒナは共食いをすることが知られている。 成体（あるいは少なくともその排泄物）にアクセスできるようにすることで、ヒナはバランスのとれた多様な細菌群集を人生の早い段階でマイクロバイオームの種とすることができ、将来的に問題のある細菌が増殖するのを防ぐことができるかもしれない。 しかし、この考えはまだ実験的に検証されていません

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