Human sample source
今回の研究で使用した133個の2PN期のヒト胚は、Stanford University RENEW Biobankから入手したもので、非幹細胞研究のために提供されたという書面によるインフォームドコンセントを得ています。 すべての胚は接合期または2PN期で凍結されており，凍結保存前に選択されていないため，これらの胚は典型的なIVF集団を表している可能性が高い。 識別解除は，スタンフォード大学機関審査委員会の承認を受けたプロトコル「The RENEW Biobank」に準拠して行われた。 保護されるべき健康情報は胚に関連付けられていませんでした。 解凍された133個の胚のうち，91個は解凍後に生きているように見えたが，残りの胚は（マイクロピペットで吸引する前に）目に見えて生存していなかったので除外された。 さらに、マイクロピペット吸引時に構造的に破損していたことと、ZPが破裂していたことから、2つの胚をデータから除外し、合計89個のヒト胚をデータセットに残しました。
ヒト胚の培養
ヒト胚は、Quinn’s Advantage Thaw Kit（CooperSurgical社製）を用いて、これまでに説明したように解凍しました26,27。 クライオバイアルやストローを液体窒素タンクから取り出し、空気に触れさせてから37℃の水浴に入れた。 解凍後，胚を0.5Mおよび0.2Mのスクロース解凍液中で，37℃でそれぞれ10分間インキュベートした． その後，胚を37℃の融解希釈液で洗浄し，10%の血清蛋白質代替物を添加したクインズアドバンテージ開裂培地（CooperSurgical社）で3〜4時間培養した。 いくつかの実験では、Eeva System（Auxogyn）を用いて胚の発育をモニターした。
マウスの胚・卵子の採取と体外受精
ハイブリッド系統（C57B6xDBA2）のF1マウス（4-6週齢の雌）をJackson Laboratoryから購入し、Lorry Lokey Stem Cell Research Buildingの動物施設で飼育した。 すべての実験は，Institutional Animal Care and Use Committee protocol #16146に基づいて行われ，Stanford UniversityのAdministrative Panel on Laboratory Animal Careによって承認された． 雌マウスに10IUの妊娠雌馬血清ゴナドトロフィン（PMSG，Sigma）10IUのヒト絨毛性ゴナドトロフィン（hCG，Sigma）を腹腔内注射して過排卵させた。 1匹の雌と同系統の8-10週齢の雄を交配させた後、卵管からM2培地（Millipore）に卵丘細胞複合体を回収し、ヒアルロニダーゼ（Sigma）で卵丘細胞を除去し、M2培地で洗浄した。 機械的測定の後、胚は10%の血清タンパク質代替物を含むQuinn’s advantage cleavage medium (CooperSurgical)で培養した。 卵子の成熟が力学に及ぼす影響を測定するために、様々な成熟段階の卵子を採取した。 GVの卵子は、PMSGの注入から48時間後に採取した。 PMSG注射の約48時間後にhCGを注射した。
胚の形態が非常に悪い場合、10個以下の胚しか生まなかったマウスから採取した場合、体外受精後に前核形成を示した胚が40％以下のグループに属する場合は、データから除外した。 胚の数が少なかったり、受精率が低かったりした場合は、実験プロトコルの一部（ホルモン注入や培地など）が胚に悪影響を与えている可能性があり、正常なマウス胚の代表ではないと判断しました。 胚をコントロール群と測定群に分けるために，形態が判別できないほどの低倍率で観察しながら，ランダムに胚を分離しました。 各実験では，陰性コントロールとして数個の胚を残し，全実験で合計35個とした（補足図5）． 動物実験のサンプルサイズは，統計的有意性を得るために必要なデータ量と，同様の研究を行った論文に見られるサンプルサイズを参考にして決定した．
マウス卵子のマイクロインジェクションと体外受精
この実験にはJackson LaboratoryのCBAマウス系統を使用しました。 4-6週齢の雌マウスに過排卵を誘発した後、メタフェース-IIで停止した卵子を回収し、卵丘細胞を除去した。 その後、卵母細胞にモノクローナル抗体18A10（abCam）を1mgml-1の濃度で約10plマイクロインジェクションした。 一部の卵子はネガティブコントロールとして保存し、水を用いたシャム注入または全く注入しないようにした。 その後、卵子は通常の体外受精の前に1時間培養された。 精子は、8-10週齢のCBAオス（Jackson Laboratory）から採取し、HTF培地（CooperSurgical）で45分間静置してから授精した。 精子懸濁液の適量を、卵母細胞を培養した培地に添加した。
胚の機械的特性の測定
胚の測定には、自動マイクロピペット吸引システムを使用し、吸引の様子を録画するために特注の光学顕微鏡を使用しました。 光顕微鏡はThorlabs社の部品を使って製作され、20倍、開口数0.4のオリンパス社製対物レンズと白色発光ダイオードの照明を使用しています。 測定を行うには、各胚をそれぞれの培地の液滴に入れ、マイクロピペットを液滴の中に下ろします。 胚は，極体がピペットの開口部と反対側を向くようにピペットで操作される。 極体の近くでは，olemma と ZP の間に空間がありますが，胚の他の部分では，このピペット周囲の空間は非常に小さいので，測定位置をコントロールできないと，結果が混乱する可能性があります。
マウス胚用のマイクロピペットは内径40μm（Origio MBB-FP-L-15），ヒト胚用のマイクロピペットは内径70μm（Origio社製）で，それぞれ特注しました。 胚を保持するために-0.03p.s.i.の保持圧をかけ、ピペットの開口部を密閉します。 続いて，-0.345p.s.i.のステップ圧力を胚に加える。 このとき，閉ループのPID制御システムを用いて所望の圧力を加える． リニアアクチュエーター（Firgelli L12）が1mlシリンジのストッパーを動かし，センサー（Honeywell SSCSNBN010NDAA5）が圧力を測定する． これらはArduino Unoマイコンを介してコンピューターに接続されており、センサーの読み取り値を中継したり、アクチュエータにリアルタイムでコマンドを与えることができます。 吸引の様子をCMOSカメラ（Thorlabs DCC1545M）を使って75f.p.s.で撮影しています。 すべてのハードウェアは、カスタムメイドのLabviewソフトウェア（National Instruments社製）を用いて制御されます。 カスタムメイドのMatlabプログラム（Mathworks）を使って，胚の吸引深度を抽出し，メカニカルモデルに適合させた． ピペットの角と開口部を特定するために，カニーエッジ検出と閾値処理を行った． また，相互相関に基づいたテンプレートマッチングを用いて，胚のエッジを経時的に自動追跡し，手動計測によるバイアスを除去した．
1細胞胚の力学モデル
マイクロピペットに吸引された胚を表現するために、修正線形弾性固体モデル（修正Zenerモデル）を使用しました。 胚に加わる力をステップ入力と仮定すると、時間経過に伴う吸引深さの方程式は次のようになります。
Where
修正Zenerモデルは、Maxwell.Kelvin-Voigt、Zenerなどの一般的に使用されている粘弾性モデルよりも選ばれました。 改良型Zenerモデルは、応答ダイナミクスの目視検査に基づいて、Maxwell、Kelvin-Voigt、Zener（Standard Linear Solid）といった一般的に使用されている粘弾性モデルの中から選ばれました。
マックスウェル体は、スプリングとダッシュポットが直列に配置されているため、段階的な圧力に対する応答は、瞬間的な伸びに続いて、指数関数的な減衰成分（変形が時間とともに増加するように反転する）があり、最後に図2cに示すように一定の速度で変形することがわかりました。
マックスウェルボディは、スプリングとダッシュポットが直列に配置されているため、ステップ圧力に対する応答は、瞬間的な伸びとその後の定常的な線形変形となります。 Kelvin-Voigtボディは、スプリングとダッシュポットが並列に配置されているため、ステップ圧力に対する応答は、吸引深さが最終的な最大深さに落ち着く、減衰する指数関数となる。 このモデルでは、胚の瞬間的な伸びや、指数成分が収まった後の直線的な変形速度を捉えることができません。 ツェナーモデルは、マックスウェル体に並列にバネを追加したもので、圧力に対する反応はケルビン・ヴォイト体と似ていますが、圧力が最初にかかったときに瞬間的に伸びるという特徴があります。
5種類のモデルのフィッティング誤差の比較を補足図10に示します。
5種類のモデルのフィッティング誤差を比較した結果を補足図10に示します。
胚の生存率と細胞周期パラメータの評価
力学的に生存している胚とそうでない胚を区別する分類法を構築する際に，生存率の代理として胚盤胞形成を用いた。 この分類法は、図2のライブバース実験で示すように、マウスで検証されました。 1日目に胚の力学的パラメータを測定した後，Auxogyn Eevaシステム内で胚を5～6日間培養し，5分ごとにフレームを撮影した。
胚の生存率予測
胚盤胞の生存率は、1日目の機械的測定値に基づいて胚の生存率を予測する分類器を訓練するためのグランドトゥルース情報として使用されました。 RBFカーネルを用いたバイナリSVM分類器を胚の機械的パラメータで学習しました。 ボックス制約（c）とRBFシグマ（σ）の最適な値は，10回のクロスバリデーションを用いて選択した．
各胚に対して合計4つの機械的パラメータが測定されたため，前方特徴選択を行い，生存率分類器に含める最適なパラメータの数を決定しました． その結果を補足図2Cに示しますが，1つのパラメータではなく2つのパラメータを使用した場合には大きな改善が見られ，3つ目のパラメータを追加した場合にはわずかな改善しか見られませんでした．
順方向の特徴選択を行うために，まず，各パラメータを単独で使用して胚を分離し，最適な分類器を見つけました。 前述のように、10倍のクロスバリデーションを行い、そのパラメータのROC曲線下面積を推定しました。 予測値が最も高いパラメータを選択した後，残りの各パラメータを用いて新たな分類器を学習し，最適化しました．
皮質顆粒の放出に関する実験では、簡単のため、生存率を最も予測するパラメータ（stiffness, k1）のみを用いて図を示しました。
マウスの生誕実験
CD1雌マウスをJackson Laboratoryから購入し、精管切除した雄と交配させて擬似妊娠のレシピエントとした。 マウスは、胚の採取に使用したものと同じ条件で飼育した。 C57B6xDBA2）F1マウスから採取した胚の力学的パラメータを測定し，これらのパラメータに基づいて胚を生存群と非生存群に選別した。 各実験では、同数の1細胞期のマウス胚（10〜15個の範囲）を、最近摘出した胚の受精卵の卵管に移植した。 この実験を4回繰り返し（補足表1）、各実験で各マウスに10〜15個の胚を移植した。 胚を移植する技術者は、どの胚がどのグループにあるかは盲検であった。 対照として，同じ発達段階の同じ数の胚を無作為に選び，仮妊娠マウスに移植した． 仔マウスは手術後20日目に期待した。 各グループ（生存、非生存、コントロール）で生まれた仔の数の差が統計的に有意であるかどうかを調べるために、χ2検定を行った。
RNA-seqサンプルの準備
RNA-seq用のサンプルを得るために、合計32個の2PNヒト胚で2回の別々の実験を行った。 胚は解凍後，培養液中で3〜4時間回復させ，機械的パラメータを測定した。 各胚のcDNAは，SMARTer Ultra Low RNAキット（Clontech社）を用いて，提供者のプロトコルに従ってtotal RNAから合成した． Covaris社による完全長cDNAのせん断後，NEBNext DNA Sample Prep Master Mix Set（New England Biolabs社）を用いて最終的なライブラリを生成し，Agilent 2100バイオアナライザーを用いて品質管理を行った。
25個の胚のうち、3個の胚は技術的な問題（RNAが回収できない）により除外されました。
25個の胚のうち、技術的な問題で3個の胚が除外されました（RNAが回収されませんでした）。
RNA-seqデータ処理
シーケンスにより、22個の胚から長さ101の約10億個のペアエンドリードが得られました。 fastq形式の生データは品質管理を行い、低品質のベースコールとアダプター配列を除去した（FastX trimmer and clipper）。 除去された配列は、コンピュータ上でSTARアライナツール67を用いて基準となるヒトゲノム（hg18）にアライメントされた。 結果として得られた.bamファイルは、アラインメント品質のためにフィルタリングされ、ソートされ、PCRの重複が除去された（SAMtools sort and rmdup）。
患者間の生物学的変異、異なる凍結プロトコル、培養液、その他の要因から生じる可能性のあるバッチ効果を考慮するために、どの胚がどの患者から来たのかを特定する必要がありました。 そこで，各胚のトランスクリプトームに含まれる配列変異を分析し，シーケンスカバレッジが良好な変異については階層的なクラスタリングを行いました（補足図11）。 22個の胚のうち、17個は「兄弟」の胚であり、5個はそれぞれの患者の唯一の胚であることがわかりました。 この5つの胚を除外した後，Rのsva69,70パッケージに含まれるComBat関数を用いて，残りの17個の胚のRNA-seqデータからバッチ効果を除去しました． 兄弟のいない5つの胚を除外すると，結果に偏りが生じる可能性がありますが，1つのサンプルだけではこれらの患者の生物学的変異を推定することができないため，除外せざるを得ませんでした。 これらのバッチ効果を除去した後のデータでは，すべての患者において，生存している胚と生存していない胚との間で，母体に遺伝する転写産物の違いが反映されていました。 RパッケージのedgeR28を用いて、調整したデータを用いて、発現量の差の解析を行った。
Gene ontology and network analysis
q-values<0.01のDE遺伝子のリストをDAVIDツール（NCBI）に渡し、BPと分子機能（MF）に関連するオントロジー用語でクラスタリングを行った。 調整後のP値<0.05を持つ用語が1つ以上あるクラスタは、統計的に有意であると判断し、表1に含めた。 各クラスター内の用語を1つの記述語句にまとめ、表1に記載した。 さらに、RのgoseqおよびGO.dbパッケージを用いて、遺伝子オントロジー解析を行いました。10個以上の遺伝子を持つすべての遺伝子オントロジーカテゴリーを、そのカテゴリー内でDEとなった遺伝子の割合の順にランク付けし、すべてのカテゴリーでDEとなった遺伝子の割合と比較しました。
IPAを用いて、DE遺伝子のリストを解析し、生存胚と非生存胚の間のlog-fold変化を調べました。
皮質顆粒染色
B6マウス由来の胚とIVF（CBAマウス由来）の胚の力学的パラメータを2つの別々の実験で接合期に測定しました。 胚は機械的パラメータに基づいて生存または非生存に分類され，その後，胚をチロード液（Sigma）に短時間さらした後，PBS（Invitrogen）で3回洗浄してZPを除去した。 脱落した胚を4％パラホルムアルデヒドで20分間室温で固定し，フルオレセインイソチオシアネートで標識したレクチン抗体（Sigma）と4,6-ジアミノ-2-フェニリンドールで染色した．
共焦点画像処理
生の画像スタックをTIFFフォーマットに変換し、カスタムMatlabスクリプトを作成して画像パラメータを抽出しました。 各スタックのすべての画像に対してコントラスト調整を行い、撮像深度が大きくなるにつれて信号が減少することを考慮し、各スタックに対して投影画像を算出しました。 大津の方法を用いた自動閾値処理、Cannyエッジ検出、円ハフ変換を行い、各細胞の位置と大きさを検出して、各細胞の細胞質を分離しました。 強度プロファイルは、各セルの円周上のパスに沿って、セル半径の95％、幅はセル半径の10％で計算しました。 画像4にプロットされたパラメータは，この強度プロファイルの(a)平均値と(b)s.d.である．
統計的検定
χ2検定を用いて，生児誕生に至った胚の割合（2.2項）が，3つの実験群（力学的に生存が予測される群，力学的に生存が予測されない群，形態のみで選別された対照群）の間で有意に異なるかどうかを検定しました（2.2項）． このテストの唯一の仮定は，どのグループ（「グループ」とは，生 産に至った胚と，生産に至らなかった胚のいずれかを指す）にも，5個未満の サンプルしか含まれていないということです．
生存しているヒト胚と生存していないヒト胚の間で発現に有意差のある遺伝子を決定するために、RのsvaおよびedgeRパッケージを使用しました。
胚の間で皮質顆粒の明るさを比較するために、Wilcoxon順位和検定を使用しました（サンプル数が少なく、Lilliefors検定による正規分布ではなかったため、t-検定は使用しませんでした）。 IP3抗体を注射したことで，胚の平均的な硬さが変化したかどうかを調べるために，抗体を注射した群とコントロールを注射した群がLilliefors検定により正規分布していると判断されたため，両側t-検定を用いた． 抗体の注入により硬さの値の分布に有意な変化が生じたことを示すために、2標本のコルモゴロフ・スミルノフ検定を用いた。 各四分位に含まれるサンプル数が非常に少なかったため、抗体注射群と対照注射群の四分位間の差を比較するためにWilcoxon順位和検定を用いた。 また、卵子の硬さの中央値が正規性の基準を満たしていなかったため、GV、MI、MIIの各ステージ間の差を検定するためにWilcoxon順位和検定を使用しました。