従来のコラーゲン・クロスリンキング
従来のCXL法は、2003年のドレスデンプロトコール、2008年の修正版、シエナプロトコールに記載されています。 2003年のドレスデンプロトコール、2008年の修正版、シエナプロトコールに記載されている従来のCXLは、最小ストローマ厚が400μmの角膜に適用され、角膜上皮の中央部7～9mmを除去した後、20％デキストリンに等モルのリボフラビン0.1％溶液を20％デキストランに溶解したものを投与した。 UVA（370nm）を3mW/cm2、30分（5.4J/cm2）で角膜中央部の直径8mmにわたって照射し、リボフラビンでストローマを飽和させた後、照射を開始する。
Kymionisらは、上皮除去後の最小角膜厚が400μm以下（範囲340～399μm）の14枚の薄い角膜に、従来のCXLを適用しました。 12ヵ月間の追跡調査では、未矯正距離視力（UDVA）、矯正距離視力（CDVA）の改善、および平均角膜測定値の減少が記録されました。 しかし、臨床的に明らかな合併症がなかったにもかかわらず、術後に内皮細胞密度が2733細胞/mm2から2411細胞/mm2へと大幅に減少したことが確認された。 0.1％等浸透圧リボフラビンと20％デキストランのフィルムは、注入1分後には約70μmの厚さになり、22分間安定していた。 このリボフラビン-デキストランフィルムを使用した場合、ヒト角膜間質の400μmにおけるUVA照射量は0.21mW/cm2と測定され、これは前述の細胞毒性レベルよりもはるかに低く、間質深部の最小厚さは400μmと設定されています。 したがって、リボフラビンフィルムによるUVAの吸収と遮蔽が、内皮の損傷を防いでいる可能性がある。
ハイポースモル リボフラビン溶液
角膜には不活性膨潤圧があり、角膜間質は等温環境下で体積が増加する傾向があります。 角膜には不活性の膨潤圧があります。 Hafeziと共同研究者は、薄い角膜のCXL前に角膜の厚さを増やすためにこの方法を適用した。 上皮を除去した後、0.1～20％のデキストラン等モルリボフラビンを30分かけて角膜に塗布した。 その後、0.1 % デキストラン低浸透圧リボフラビンを、最も薄い部分の角膜厚が400 μmになるまで投与した後、UVA照射を開始した。 著者らは、この方法で治療した20眼で角膜の安定化が見られたと報告している。 その後のRaiskupらの研究では、上皮除去後に0.1％の低オスモルリボフラビンを、リボフラビン飽和角膜が最小の400μmに達するまで塗布した。 この研究では、治療の1年後に、CDVAおよびケラトメトリック値は変化せず、間質に検出可能な瘢痕病変の形で角膜の損傷は登録されませんでした。 一方、等モルのリボフラビン溶液で治療した眼では、CXL後の薄い角膜に恒久的な間質の瘢痕が発生する傾向があった。 Guらは、0.1%の低オスモルリボフラビン溶液をCXL施術を受けた8つの薄い角膜の飽和および膨潤液として使用しました。
術前に角膜を膨らませることで、CXLの適応範囲を薄い角膜にまで広げることができます。 しかし、Hafezi氏らは、非常に薄い角膜（上皮除去後の最小厚さ268μm）にCXLを行っても円錐角膜の進行を止めることができなかった症例を報告しています。しかし、低オスモルのリボフラビン溶液で膨潤させたところ、厚さが406μmまで増加し、術後に内皮の有害反応は観察されませんでした。 そこで著者らは、CXLを効果的に行うためには、まだ決定されていない最小限の間質の厚さがあるという仮説を立てた。
Kaya氏らとSoeters氏らは、薄い角膜に低濃度リボフラビン溶液を用いてCXLを行う際、術中に角膜厚を測定した。 その結果、人工的な膨潤効果は一過性のものであり、UVA照射の有無にかかわらず、等浸透圧のリボフラビン（デキストラン入り）を10分および30分塗布すると、最も薄いパチメーターの測定値が有意に減少することがわかりました。 また、0.1〜20％のデキストラン・リボフラビン等モル溶液を投与した後、角膜深部の薄さが減少したことが他の研究で報告されている。 著者らは、角膜の厚さの減少は、デキストランの高オンコシス効果によって誘発されたと推測している。 Vetter らは、死後間もない豚の新鮮な眼において、角膜中央部の厚さに対する様々なリボフラビン 0.1 および 0.2 % の調整効果を評価しました。 その結果、組成物の浸透圧と処理した角膜の膨潤挙動には相関が見られなかったが、デキストラン濃度と膨潤効果には逆の相関が確認された。 同時に、デキストランを含まない低浸透圧リボフラビンを塗布することで、角膜上の低浸透圧リボフラビン膜の吸収・遮蔽効果が低下すると、間質での照射レベルが上昇し、内皮がより高いリスクにさらされることになる。 そのため、角膜を400μm以上に膨らませるか、低分子溶液中のリボフラビンの濃度を上げる必要がある。 そのため、安定した膜を形成するために等粘性の特性を持つ新しいリボフラビン溶液を開発することで、CXLの安全性を高めることができると考えられた。 さらに、角膜上皮による蒸発抵抗の不足や、内皮ポンプの活性化も角膜の菲薄化につながる可能性がある。 リボフラビン飽和時には瞼鏡を外し、照射時間の短い（高出力の）照射装置を使用することが有効であると提案されました。 また、CXL治療中に角膜の厚さをモニターすることも重要であると考えられます。 人工的に膨らませた角膜では、水和した間質に含まれるコラーゲンの相対的な濃度が低いため、CXLによる生体力学への影響は少ないと考えられます。
上皮コラーゲンの架橋
塩化ベンザルコニウム、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、トロメタモールなどの物質は、特に組み合わせた場合、リボフラビンなどの親水性高分子の上皮透過性を高めます。 リボフラビンが上皮を介して角膜間質に浸透するようにエンハンサーを加えることで、上皮を剥離せずにCXLを行うことができます（経上皮型CXL）。 Transepithelial CXLは、従来のCXLに比べ、術後早期の痛みや一時的な視力の低下、感染性角膜炎などの合併症を軽減することが提案されています（実証はされていません）。
Filippelloらは、角膜の厚さ（上皮を含む）の平均値が412±21μmの角膜症患者20人に、エンハンサーとしてトロメタモールとEDTAナトリウムを使用し、経皮的CXLを適用しました。 この治療により、18ヵ月後の追跡調査では、治療を受けたすべての眼で円錐角膜の進行を止めることができました。 また、すべての視覚的および地形的な評価項目において、統計的に有意な改善が見られたが、反対側の未治療の眼ではすべてのパラメータが悪化した。 Spadeaらは、薄い角膜に同様のプロトコルを使用し、角膜症の眼の安定化に効果があることを確認しました。 しかし、視覚的および地形的な改善はわずかであった。
Wollensakらは、局所麻酔薬と塩化ベンザルコニウムをエンハンサーとして使用した経上皮CXLによって、ヒト角膜の角膜剛性が64％向上したのに対し、脱上皮を伴うCXLを使用した場合は320％向上したと推定しています。 Filippelloらの研究では、術後の境界線の深さが約100μmであったのに対し、従来の上皮除去を伴うCXLでは約300μmであったことから、その安全性と再現性が疑問視されています。 SeilerとHafeziは、CXL後の境界線を初めて報告し、その深さを共焦点顕微鏡で測定したCXL後の角膜細胞の死と関連づけた。 彼らは、この線が架橋された前眼部と未処理の後眼部の間の移行ゾーンを表していると示唆した。 経皮的アプローチにより境界線が浅くなったのは、リボフラビンのストロマへの浸透が限られているためなのか、それともリボフラビンを含浸させた無傷の角膜上皮を遮蔽することでUVA光の透過が抑えられたためなのかは不明である。 リボフラビンの角膜間質への浸透を促進するために、微小電流を用いた非侵襲的な送達システムであるイオントフォレーシス支援経皮CXLが最近考案された。 前臨床試験の結果、イオントフォレーシスは、エンハンサーアシスト経皮CXLと比較して、角膜間質中のリボフラビン濃度を高めることができましたが、従来の上皮オフCXLで到達していた濃度には達しませんでした。 イオントフォレーシスを用いた経上皮CXLでは、従来のCXLに比べて境界線の見分けがつきにくく、浅い印象を受けたが、エンハンサーを用いた経上皮CXLと比較すると、深さや可視性の点で従来のCXLに近い特徴が見られた。
カスタム上皮剥離技術
Kymionis らは、最も薄い間質が 400 μm 未満の角膜症の眼とレーシック後の角膜症の眼で、カスタムのパチメトリーガイドによる上皮剥離を用いて CXL を実施しました。 この修正されたCXLアプローチでは、直径8.0mmの角膜上皮が除去され、円錐の頂点上の最も薄い部分に相当する小さな局所的な角膜上皮の領域が残されました。 著者らは、角膜間質の脱水を防ぎ、間質のリボフラビン濃度を維持するために、UVA照射中に低浸透圧のリボフラビンを使用することを提案した。 術後9カ月目には、治療を受けた眼のトポグラフィーは安定しており、内皮細胞密度の変化も認められなかった。 しかし、その後のKayaらの研究では、錐体部の上皮が、その下の間質をCXL効果から免れていることが示唆されている。 処置の4週間後、上皮が剥がれた部分にはストロマのヘイズと境界線が検出されたが、上皮が無傷の部分には検出されなかった。コーン領域の外側の深部上皮化したストロマには、全角細胞のアポトーシスとハニカム状の浮腫が見られたが、無傷の上皮の下にはそれはほとんど見られなかった。 一方、Mazzottaらは、1年間の追跡調査を行った10個の眼において、上皮島の下では平均160μmの深さで角質細胞のアポトーシスが見られたのに対し、脱上皮領域の下では250μmであったことを示しました。
以前の研究では、グリッドパターンで上皮を剥離した後のリボフラビンの間質への取り込みは不均一で、上皮を剥離した部分のすぐ下の間質には完全に浸透し、無傷の上皮の下の間質には浸透しないことが示されていました。 リボフラビンの飽和状態が不十分で、上皮がUVA放射線を吸収する能力が低いと、錐体部でのCXL効果が低下し、処置全体の効果に影響を及ぼす可能性がある。
Contact lens-assisted collagen cross-link
Contact lens-assisted CXL (CACXL)は、Jacobらによって導入されました。 Soflens社の1日使い捨てソフトコンタクトレンズ（直径14 mm、底面湾曲8.厚さ90μmのヒラフィルコン製、UVフィルターなしのソフトコンタクトレンズ（直径14mm、底面曲率8.6mm、Bausch & Lomb）を、デキストランに溶解した等モルのリボフラビン0.1％に30分間浸した後、リボフラビンで飽和した深部上皮に装着した。 コンタクトレンズとリボフラビン膜を含む角膜の最小厚さが400μm以上であることを確認した後、3.0mW/cm2のUVA照射を30分間行った。 UVA照射中は、角膜の飽和状態を維持し、角膜前とコンタクトレンズ前のリボフラビン膜を均一にするために、3分ごとにリボフラビン溶液を注入した。
CACXLで治療した14眼において、コンタクトレンズとリボフラビンフィルムを含めると、角膜の最小厚さが平均108μm増加したことが報告されました。 平均6.1±0.3ヵ月（範囲：6～7ヵ月）の追跡調査では、ストローマの境界線の術後平均深度は252.9μmと測定されました。 著しい内皮の消失や術後の内皮障害の兆候は認められなかった。
CACXLの利点は、角膜の膨潤性に依存せず、デスメット膜のひだや内皮の損傷の原因となる角膜の浮腫が生じないことです。 しかし、CACXLでは、リボフラビンフィルムと染み込んだコンタクトレンズによる吸収のために、角膜ストロマレベルの表面放射照度が40～50%低下します。 さらに、CXLのプロセスで重要であることが証明されている酸素の拡散が、コンタクトレンズによって妨げられる可能性があります。 その結果、CXLの効果が低下する可能性があります。 患者数が少ないこと、追跡期間が短いこと、対照群がないことが本研究の限界である。