Abbiamo tutti sentito parlare della centrifugazione, o più specificamente, le storie dell’orrore associate alla centrifugazione che va male, come nel caso del famoso incidente della centrifugazione Cornell. La maggior parte degli errori legati alla centrifugazione sono dovuti alla cattiva gestione da parte dell’utente. Pertanto, è fondamentale capire perché facciamo quello che facciamo durante la centrifugazione per evitare di danneggiare la macchina e il personale. Qui, ho elencato alcuni dei problemi più comuni che possono essere facilmente trascurati durante la centrifugazione e perché sono così importanti per una corretta gestione di una centrifuga.
It’s All About Balance
La centrifugazione produce forze centrifughe per separare efficacemente i componenti del campione in base a dimensioni e densità. Piccoli squilibri di peso possono causare vibrazioni anomale che possono danneggiare il rotore. Una centrifuga sbilanciata è pericolosa quanto una reazione chimica instabile. Non solo può danneggiare lo strumento, ma può anche iniziare un effetto domino di catastrofi fino al guasto dello strumento, alla rottura del campione che potrebbe rilasciare contaminanti potenzialmente dannosi nell’ambiente (campioni infettivi, aerosol dannosi, ecc.), e lesioni all’utente, in generale, con conseguente distruzione su larga scala e un grande rischio per la sicurezza.
A) La necessità di un bilanciamento preciso ad alta velocità
Il bilanciamento preciso è fondamentale durante le centrifugazioni ad alta velocità. Per capirlo meglio, dobbiamo tornare ad alcuni concetti fisici di base. Secondo la seconda legge di Newton, la forza (F) è uguale alla massa (M) per l’accelerazione (A). Così, la forza centrifuga generata durante la centrifugazione è direttamente proporzionale alla massa e all’accelerazione del campione. Durante il moto circolare, l’accelerazione è legata alla velocità di rotazione e al raggio del rotore. Ad alte velocità, anche lievi variazioni nella massa del campione possono portare ad un sostanziale sbilanciamento della forza, che potrebbe essere catastrofico.
B) Bilanciamento basato sul tipo di rotore
A prescindere dal fatto che la centrifuga abbia un rotore ad angolo fisso o a secchio oscillante, due importanti fattori da considerare per il bilanciamento sono il volume del campione e la disposizione simmetrica dei tubi. È importante assicurarsi che i volumi del campione siano uguali in tutte le provette e che le provette siano posizionate direttamente una di fronte all’altra nella centrifuga. Se c’è un numero non uniforme di provette, pareggialo aggiungendo una provetta in più riempita d’acqua allo stesso volume delle provette sperimentali. Se le soluzioni non sono di densità simile (ad esempio, acetone e acqua), le provette dovrebbero essere di massa uguale piuttosto che di volume per essere correttamente bilanciate. Un ulteriore fattore da considerare nel caso di rotori a secchiello oscillante è quello di assicurarsi che tutte le fessure contengano secchielli del rotore adeguati alla macchina e dello stesso peso.
2. RCF vs. RPM e perché è importante
RCF (forza centrifuga relativa o forza g) e RPM (giri al minuto) sono comunemente usati per descrivere la velocità centrifuga. Tuttavia, queste unità sono completamente diverse. RPM denota la velocità di rotazione, che dipende dal raggio del rotore. RCF denota la forza centrifuga sui campioni e tiene conto sia del raggio del rotore che della velocità di rotazione. Lo stesso RCF può essere ottenuto in centrifughe con rotore di dimensioni diverse regolando opportunamente il numero di giri. Questo rende l’RCF l’unità di riferimento per descrivere le velocità centrifughe in quanto può essere confrontato tra le centrifughe, mentre l’RPM è costante solo per le centrifughe con lo stesso raggio del rotore. In poche parole, RPM non è uguale a RCF, e le impostazioni di velocità RPM devono essere convertite in RCF per garantire che venga applicata la forza centrifuga corretta.
3. Tempo, velocità e centrifugazione
La scelta della velocità di centrifugazione dipende dalla dimensione e dalla fragilità delle particelle nel campione. Più piccola è la dimensione delle particelle, maggiore è la velocità di centrifugazione. Per esempio, le cellule batteriche sono pellettate a velocità più elevate (2000-10.000 x g) rispetto alle cellule dei mammiferi (500-2000 x g). Inoltre, velocità di centrifugazione inferiori possono essere utilizzate con campioni più fragili.
Un altro fattore critico che influenza l’efficienza della separazione è l’RCF. RCF è proporzionale al raggio del rotore e al quadrato di RPM. A causa di questa dipendenza quadratica di RCF da RPM, velocità di centrifugazione di 1000 RPM per 5 minuti e 500 RPM per 10 minuti non sono intercambiabili. La prima produce un RCF molto più grande della seconda. Quindi, è importante considerare l’RCF quando si determina la velocità e il tempo per la centrifugazione.
4. Centrifugazione a diverse temperature
La centrifugazione genera calore, che può aumentare la temperatura all’interno di una centrifuga (a volte, di più di 15°C). Questo può influenzare la stabilità dei campioni sensibili alla temperatura. In questi casi, le centrifughe refrigerate sono di solito preferite. Tuttavia, le temperature costanti possono essere mantenute anche in una centrifuga ambientale. La temperatura del campione durante la centrifugazione è influenzata principalmente da tre fattori: il materiale del rotore, la forma del rotore e la velocità di rotazione.
A) Materiale del rotore
Durante la centrifugazione, la temperatura può essere influenzata dalla conduttività termica del materiale del rotore. I rotori in metallo, come l’acciaio e l’alluminio, hanno un’alta densità e un’alta conducibilità termica. Trasferiscono il calore in modo efficiente e si raffreddano rapidamente. Al contrario, materiali come i polimeri e le fibre di carbonio sono isolanti termici e mantengono una temperatura costante.
B) Forma del rotore
La forma del rotore determina il flusso d’aria all’interno di una centrifuga, in modo simile a come le pale di un ventilatore elettrico influenzano il flusso d’aria dentro e fuori la macchina. Ottimizzare il flusso d’aria all’interno di una centrifuga attraverso la forma del rotore è essenziale per mantenere la temperatura.
C) Velocità
La velocità di rotazione è direttamente proporzionale all’aumento della temperatura: a velocità più elevate, si genera più calore. È importante capire la velocità massima della centrifuga e la gamma di velocità che mantengono un intervallo di temperatura che non cambierà il risultato dell’esperimento. Di solito, queste informazioni saranno fornite dal produttore nel manuale dell’attrezzatura per aiutare l’utente a capire le limitazioni e ad aggirarle.
5. Frenare o non frenare
Durante la centrifugazione, la separazione dei componenti del campione continua durante la fase di decelerazione. Molte centrifughe offrono la possibilità di controllare le impostazioni di decelerazione (freni) per fermarsi più velocemente, ma quando abbiamo davvero bisogno di questa opzione, e qual è l’effetto sui risultati del campione?
Frenare può essere particolarmente utile durante le centrifugazioni che coinvolgono estrazioni di acido nucleico o pellettizzazione di cellule batteriche, che non sono influenzate da un arresto improvviso. Tuttavia, per gli esperimenti che sono più sensibili alla brusca decelerazione, come l’isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico e le centrifugazioni a gradiente, la frenata può causare il rimescolamento degli strati separati. In questi casi, è più adatto spegnere il freno in modo che la decelerazione sia graduale e non disturbi i gradienti. Alcune centrifughe forniscono una gamma di impostazioni di decelerazione. Questo può essere utile quando si centrifugano cellule di mammiferi, che sono sensibili alle decelerazioni improvvise ma, allo stesso tempo, richiedono una certa decelerazione per ridurre al minimo il tempo impiegato dalla centrifuga per arrivare all’arresto.
6. Dov’è il pellet?
Una delle applicazioni più comuni della centrifugazione è il pellet di campioni, come cellule batteriche, cellule di mammiferi o acidi nucleici. Quando si utilizza un rotore ad angolo fisso, l’angolo del rotore determina la posizione del pellet. Per essere sicuri di sapere sempre dove si trova il pellet, una buona pratica di laboratorio è quella di girare sempre le provette con le cerniere del coperchio posizionate nello stesso orientamento (per esempio, le cerniere del coperchio rivolte verso l’esterno). Questo è particolarmente utile per prevenire la perdita di campione durante le estrazioni di DNA quando il pellet è quasi invisibile dopo la fase di lavaggio con etanolo. Nel caso dei rotori a secchiello oscillante, il pellet si forma principalmente sul fondo della provetta.
In generale, spero che la lettura di questo articolo vi aiuti a lavorare più comodamente e con più fiducia con le centrifughe. Se hai visto o vissuto un disastro con la centrifuga, vai avanti e condividi la tua storia insieme ad eventuali suggerimenti e trucchi per garantire la filatura felice nei commenti qui sotto. Che la forza sia con voi!
- Eppendorf. Sicurezza della centrifuga.
- Eppendorf. Conducibilità termica.
- Sigma. Temperatura del campione durante la centrifugazione ad alta produttività a temperatura ambiente utilizzando Sigma 4-5L. Rimescolamento del campione durante le separazioni a gradiente di densità con il rotore ad angolo fisso Thermo Scientific Fiberlite F21-8x50y mL.
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