Dal 1853 al 1860 Billroth fu assistente nella clinica chirurgica di Bernhard von Langenbeck alla Charité di Berlino. Lì fu anche apprendista di Carl Langenbuch. Nel 1860, Billroth accettò un’offerta dall’Università di Zurigo per diventare la cattedra di chirurgia clinica, diventando direttore dell’ospedale e della clinica chirurgica di Zurigo. L’inizio della sua carriera in Svizzera fu poco promettente: durante il suo primo semestre di insegnamento, ebbe solo dieci studenti, e lui stesso disse che il reddito che riceveva dal suo studio privato era insufficiente a pagare la sua tazza di caffè mattutina. La sua reputazione però crebbe rapidamente; Billroth aveva una personalità contagiosa, che attirava sia gli studenti che i tirocinanti di chirurgia nelle sue file. Era amato dai suoi studenti, ed era un efficace insegnante universitario e di laurea. Gli studenti accorrevano alle sue lezioni, e con la cooperazione di colleghi energici, fu in grado di elevare la facoltà di medicina di Zurigo a una posizione di rilievo tra le scuole di lingua tedesca in pochi anni.
Mentre era a Zurigo, Billroth pubblicò il suo classico libro di testo Die allgemeine chirurgische Pathologie und Therapie (Patologia e terapia chirurgica generale) (1863). Allo stesso tempo introdusse il concetto di audit, pubblicando tutti i risultati, buoni e cattivi, che portava automaticamente a una discussione onesta sulla morbilità, la mortalità e le tecniche – con conseguenti miglioramenti nella selezione dei pazienti.
Fu nominato professore di chirurgia all’Università di Vienna nel 1867, in successione a Franz Schuh; lì, praticò la chirurgia come capo della seconda clinica chirurgica presso l’Allgemeine Krankenhaus (Ospedale Generale di Vienna). Anche se pose le basi della sua fama a Zurigo, fu a Vienna, un teatro più grande e più cospicuo, che si affermò come la potenza che era nel mondo chirurgico. Un suo discorso del 1875, in cui protestava contro l’afflusso di studenti di medicina ebrei, è stato annoverato come uno dei primi eventi nello sviluppo dell’antisemitismo politico viennese.
Durante la guerra franco-prussiana, Billroth fece un eccellente lavoro nell’ospedale militare di Mannheim e Weissenburg, curando una varietà di orribili ferite del campo di battaglia con interventi aggressivi e ambiziosi; egli incarnò la sua esperienza di chirurgia di guerra nelle sue Lettere chirurgiche da Mannheim e Weissenburg. Fu così impressionato dagli orrori della guerra che in seguito fu un ardente sostenitore della pace. Il 3 dicembre 1891 tenne un discorso sulla cura dei feriti in guerra che fece molto scalpore e portò alla votazione di grandi somme di denaro da parte delle camere legislative austriache per la fornitura di mezzi adeguati di soccorso per i feriti.
Non si limitò solo alla chirurgia, e condusse ampie ricerche su un disturbo che all’epoca colpiva molti pazienti chirurgici: la febbre delle ferite. Il suo trattato sulla febbre delle ferite, Untersuchungen über die Vegetationsformen von Coccobacteria septica (1874; “Investigations of the Vegetal Forms of Coccobacteria septica”) concluse che la causa era batterica; Billroth fu veloce ad usare tecniche antisettiche nella sua pratica chirurgica, e il numero di pazienti chirurgici afflitti da febbre delle ferite diminuì notevolmente. Con la minaccia di infezioni chirurgiche fatali diminuita grazie al suo lavoro e a quello di altri, Billroth procedette a rivolgere la sua attenzione alla chirurgia e al campo pionieristico di alterare o rimuovere organi che erano stati precedentemente considerati inaccessibili.
Uno dei primi ad adottare il “camice bianco” (come mostrato nel dipinto di Seligmann del 1890 ca. Billroth fu direttamente responsabile di una serie di punti di riferimento in chirurgia; nel 1872 fu il primo a eseguire un’esofagectomia, rimuovendo una sezione dell’esofago e unendo le parti rimanenti. Nel 1873, eseguì la prima laringectomia, asportando completamente una laringe cancerosa. Fu il primo chirurgo ad asportare un cancro rettale e nel 1876, aveva eseguito 33 operazioni di questo tipo. Nel 1881, Billroth aveva fatto sembrare la chirurgia intestinale quasi un luogo comune. Ma il suo risultato più famoso è senza dubbio la prima gastrectomia di successo per il cancro gastrico. Il 29 gennaio 1881, dopo molti tentativi infruttuosi, Billroth eseguì la prima resezione di successo per un carcinoma antrale su Therese Heller, che visse per quasi 4 mesi e morì di metastasi al fegato. Realizzò questa operazione chiudendo il lato della curvatura maggiore dello stomaco e anatomizzando la curvatura minore del duodeno, in un’operazione che è ancora oggi conosciuta come Billroth I.
L’attività letteraria di Billroth fu molto vasta, con un numero totale di libri e articoli pubblicati di cui fu autore di circa centoquaranta. Collaborò con Franz von Pitha a un Textbook of General and Special Surgery (1882). A questo, Billroth contribuì alla sezione sulla scrofolosi e tubercolosi, lesioni e malattie del seno, strumenti e operazioni, ustioni, congelamento, ecc.
Billroth trasmise il suo spirito intellettuale irrequieto a numerosi studenti illustri, creando la “Scuola Billroth” di seguaci. Nessun aspetto della sua professione sembrava sfuggire al suo intenso esame, che si trattasse di ricerca, insegnamento, amministrazione o infermieristica. Non solo aveva qualcosa di prezioso da dire su ognuno di essi, ma spesso faceva in modo che le sue idee diventassero realtà concrete. In tutte le sfere che cercava di influenzare, era guidato da una fede nell’unità della scienza e dell’arte, e dalla fiducia nella propria capacità di effettuare il cambiamento.
Billroth fu determinante nello stabilire la prima scuola moderna di pensiero in chirurgia. Aveva idee radicali sulla formazione chirurgica, sostenendo un apprendistato chirurgico prolungato al completamento degli studi medici che consisteva in un lavoro preliminare negli ospedali seguito dall’esecuzione di operazioni su cadaveri e animali da esperimento. Questo sarebbe seguito da un assistentato di 2-3 anni in un dipartimento chirurgico con studi della letteratura chirurgica e l’acquisizione di competenze pratiche avanzate. Tra i suoi discepoli c’erano luminari come Alexander von Winiwarter, Jan Mikulicz-Radecki e John B. Murphy. Il pionieristico programma di residenza chirurgica di William Halsted fu notevolmente influenzato dai metodi di educazione chirurgica di Billroth.