Nel 1993, mentre Santoro studiava giornalismo alla PUC-Rio, è entrato nel laboratorio di attore di Rede Globo. Santoro ha poi recitato in molte telenovelas di Globo, come Olho no Olho (1993), Pátria Minha (1994), Explode Coração (1995), O Amor Está no Ar (1997), Suave Veneno (1999) e Mulheres Apaixonadas (2003), oltre alla miniserie Hilda Furacão (1998), nel ruolo di un prete. Santoro è stato anche il doppiatore del personaggio titolare di Stuart Little e del suo sequel nelle copie doppiate in Brasile.
Il suo primo ruolo importante in una produzione cinematografica è arrivato nel 2001, con Bicho de Sete Cabeças (Brainstorm) del regista brasiliano Laís Bodansky. Alla fine del film, ha ricevuto una standing ovation dal pubblico. Ha anche vinto il trofeo di miglior attore del festival. Dopo Bicho, la sua reputazione di attore si è consolidata ed è stato scelto come protagonista maschile in Abril Despedaçado (Behind the Sun), uno dei candidati per il miglior film straniero ai Golden Globe 2002. Nel film di Hector Babenco del 2003 Carandiru ha interpretato Lady Di, una prigioniera transessuale.
Il regista canadese Robert Allan Ackerman ha scritturato Santoro per la sua produzione televisiva The Roman Spring of Mrs. Stone dopo essere stato ipnotizzato dalla sua performance in Bicho de Sete Cabeças. Poiché Santoro non aveva un agente in Nord America, Ackerman contattò il padre di Santoro. Trascorse due mesi di riprese a Roma, accanto ad attori famosi come Helen Mirren e Anne Bancroft. Poco dopo aver finito le riprese di Mrs. Stone, ricevette un’offerta dalla Columbia Pictures per una parte nel blockbuster Charlie’s Angels: Full Throttle. La sua performance in Charlie’s Angels ha dato il via alla sua carriera a Hollywood. Dopo Charlie’s Angels, ha interpretato il personaggio di Karl, l’enigmatico capo designer e interesse amoroso del personaggio di Laura Linney, nella commedia romantica Love Actually, in cui recitano anche Colin Firth, Lucia Moniz, Hugh Grant, Emma Thompson, Keira Knightley e Rowan Atkinson.
Ha anche iniziato a lavorare nel mondo della pubblicità, essendo apparso in una campagna commerciale con Gisele Bündchen nel 2002. Ha interpretato il protagonista maschile in No. 5 The Film, lo spot di 3 minuti per Chanel, diretto da Baz Luhrmann insieme a Nicole Kidman nel 2004.
Nel 2006, Santoro è entrato nel cast di Lost come sopravvissuto del volo Oceanic 815, Paulo. La sua prima apparizione è stata nell’episodio intitolato “Further Instructions”. Il suo personaggio è stato ucciso nell’episodio “Exposé”. Ha anche dato voce al suo personaggio Paulo nel dub portoghese per il Brasile.
Santoro è stato scelto per il ruolo dell’imperatore persiano Serse nel film 300, basato sull’omonimo fumetto di Frank Miller, nel 2006. Il ruolo aveva molti requisiti speciali, come un allenamento intensivo per la fisicità del ruolo (Santoro aveva perso 24 chili per lavorare in una miniserie brasiliana), un ampio lavoro di computer grafica per ritrarre Santoro, alto 1,2 metri, come il re dei 7 piedi, un processo di applicazione del trucco di quattro ore e mezza e la rimozione completa dei peli del corpo di Santoro prima con la ceretta e poi con la rasatura quando questa si è rivelata troppo dolorosa. Le sue sopracciglia sono state mantenute intatte, tuttavia, coperte con protesi e disegnate piuttosto che essere rasate. Santoro ha letto le opere di Erodoto, uno storico greco antico, per prepararsi alla sua parte. Riguardo a Serse, ha dichiarato:
È ricco, è arrogante, è un megalomane molto instabile. Vuole solo conquistare il mondo. La sua ambizione è illimitata. Vuole la gloria; vuole la vittoria; vuole la fama eterna. Sotto tutto questo volere, però, è in definitiva debole e molto insicuro.
Per il suo ruolo in 300, Santoro è diventato il primo attore brasiliano nominato agli MTV Movie Awards nella categoria del miglior cattivo. Tuttavia non ha vinto, e il premio è andato a Jack Nicholson per The Departed.
Ha interpretato il defunto calciatore Heleno de Freitas nel film Heleno del 2012. Santoro ha recitato accanto ad Arnold Schwarzenegger nel film del 2013 The Last Stand. Santoro ha interpretato Garriga nel film drammatico di Will Smith Focus (2015).
Santoro ha interpretato Gesù nel film d’azione storico Ben-Hur del 2016 e ha ricevuto la benedizione personale di Papa Francesco per questo ruolo.