Human sample source
Un totale di 133 embrioni umani allo stadio 2PN utilizzati nel presente studio sono stati ottenuti dalla Stanford University RENEW Biobank, con il consenso informato scritto che sono stati donati per la ricerca non staminale. Tutti gli embrioni sono stati congelati allo stadio zigotico o 2PN, ed è molto probabile che questi embrioni rappresentino la tipica popolazione IVF, poiché non sono stati selezionati prima della crioconservazione. La de-identificazione è stata condotta in conformità con il protocollo ‘The RENEW Biobank’, che è stato approvato dal Stanford University Institutional Review Board. Nessuna informazione sanitaria protetta è stata associata agli embrioni. Dei 133 embrioni scongelati, 91 sono apparsi vivi dopo lo scongelamento, e gli altri sono stati esclusi perché visibilmente non vitali (prima di qualsiasi aspirazione della micropipetta). Altri due embrioni sono stati esclusi dai nostri dati perché erano strutturalmente danneggiati durante l’aspirazione della micropipetta e a causa della rottura della ZP, lasciandoci con 89 embrioni umani totali nel nostro set di dati. Questi 89 embrioni umani sono stati scongelati e misurati in gruppi più piccoli nel corso di sei esperimenti separati.
Cultura embrione umano
Gli embrioni umani sono stati scongelati utilizzando un Advantage Thaw Kit Quinn (CooperSurgical) come descritto prima26,27. In breve, cryovials o cannucce sono stati rimossi dal serbatoio di azoto liquido ed esposti all’aria prima di essere messo in un bagno d’acqua a 37 ° C. Una volta scongelato, gli embrioni sono stati incubati in 0,5 e 0,2 M saccarosio scongelamento medio a 37 ° C per 10 minuti ciascuno. Gli embrioni sono stati poi lavati in soluzione diluente scongelamento a 37 ° C e coltivato per 3-4 h in vantaggio di Quinn media scissione (CooperSurgical) integrato con 10% di proteine del siero sostituto (CooperSurgical). In alcuni esperimenti, gli embrioni sono stati monitorati per il loro sviluppo utilizzando il sistema Eeva (Auxogyn).
Mouse raccolta di embrioni e ovociti e FIVET
Il ceppo ibrido (C57B6xDBA2) topi F1 (4-6 settimane-vecchio femmine) sono stati acquistati dal Jackson Laboratory e mantenuti nella struttura animale nel Lorry Lokey Stem Cell Research Building. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in base al protocollo istituzionale Animal Care and Use Committee # 16146, che è stato approvato dal pannello amministrativo sulla cura degli animali da laboratorio presso la Stanford University. In breve, i topi femmina sono stati superovulati mediante iniezione intraperitoneale di 10IU gonadotropina siero di giumenta incinta (PMSG, Sigma) 10IU gonadotropina corionica umana (hCG, Sigma). Dopo l’accoppiamento di una femmina con un maschio di 8-10 settimane dello stesso ceppo, i complessi cumulo-oociti sono stati raccolti dagli ovidotti in media M2 (Millipore) e le cellule cumulo sono state rimosse in ialuronidasi (Sigma) e lavate in media M2. Dopo le misurazioni meccaniche, gli embrioni sono stati coltivati nel mezzo di scissione di vantaggio di Quinn (CooperSurgical) con il 10% di sostituto della proteina del siero (CooperSurgical). Per misurare l’effetto della maturazione degli ovociti sulla meccanica, gli ovociti sono stati raccolti in varie fasi di maturazione. Gli ovociti GV sono stati raccolti 48 ore dopo l’iniezione di PMSG. Circa 48 ore dopo l’iniezione di PMSG, è stato iniettato hCG. Gli ovociti MI sono stati raccolti 5-6 ore dopo l’iniezione di hCG, e gli ovociti MII sono stati raccolti 18-20 ore dopo l’iniezione di hCG.
Gli embrioni sono stati esclusi dai nostri dati se mostravano una morfologia molto scarsa, se provenivano da topi che hanno prodotto meno di 10 embrioni o se erano in un gruppo in cui meno del 40% degli embrioni ha mostrato la formazione del pronucleo dopo la FIV. Se i topi producevano troppo pochi embrioni o i tassi di fecondazione erano troppo bassi, abbiamo ritenuto che alcune parti del protocollo sperimentale (iniezione di ormoni, media, e così via) devono aver influenzato negativamente gli embrioni e quindi potrebbero non essere rappresentativi di embrioni di topi normali. Per ordinare gli embrioni in gruppi di controllo e di misura, sono stati separati a caso mentre venivano visti sotto un ingrandimento abbastanza basso che la morfologia era difficile da distinguere. Solo alcuni embrioni sono stati tenuti come controlli negativi in ogni un esperimento, per un totale di 35 su tutti gli esperimenti (Fig. 5 supplementare). Dimensioni del campione per gli esperimenti animali sono stati determinati in parte dalla quantità di dati necessari per raggiungere la significatività statistica, e in parte da dimensioni del campione visto in pubblicazioni con ricerche simili. Dati di formazione meccanica e blastocisti per i 282 embrioni di topo che abbiamo misurato (Fig. 4 supplementare e Fig. 5 supplementare) sono stati raccolti nel corso di 15 esperimenti separati.
Microiniezione di ovociti di topo e IVF
Un ceppo di topo CBA da Jackson Laboratory è stato utilizzato in questo esperimento. Dopo la superovulazione indotta di topi femmina di 4-6 settimane, gli ovociti arrestati in metafase II sono stati raccolti e le cellule del cumulo rimosse. Gli ovociti sono stati poi microiniettati con ∼10 pl di anticorpo monoclonale 18A10 (abCam) ad una concentrazione di 1 mg ml-1. Alcuni ovociti sono stati tenuti come controlli negativi e sono stati sottoposti a una finta iniezione con acqua o a nessuna iniezione. Gli ovociti sono stati poi coltivati per un’ora prima della FIV convenzionale. Gli spermatozoi sono stati raccolti da maschi CBA di 8-10 settimane (Jackson Laboratory) e lasciati capacitare in media HTF (CooperSurgical) per 45 minuti prima dell’inseminazione. Una quantità appropriata della sospensione spermatica è stata aggiunta alla goccia di media dove sono stati coltivati gli ovociti. Nessun campione è stato escluso da questo esperimento, e gli ovociti sono stati ordinati in gruppi di controllo contro gruppi misurati senza riguardo per la morfologia e in un ordine casuale.
Misurazione delle proprietà meccaniche degli embrioni
Un sistema automatico di aspirazione con micropipetta è stato utilizzato per misurare gli embrioni, e un microscopio ottico costruito su misura è stato utilizzato per registrare il video dell’aspirazione. Il microscopio ottico è stato costruito con parti di Thorlabs, e utilizza un obiettivo Olympus × 20, con apertura numerica di 0,4 e illuminazione a diodi emettitori di luce bianca. Per condurre una misurazione, ogni embrione è posto nella sua goccia di media e la micropipetta viene abbassata nella goccia. L’embrione viene manipolato con la pipetta in modo che il corpo polare sia rivolto lontano dall’apertura della pipetta. Il mancato controllo della posizione di misurazione potrebbe confondere i nostri risultati, poiché c’è uno spazio tra l’oolemma e lo ZP vicino al corpo polare, mentre questo spazio perivitellino è molto più piccolo intorno al resto dell’embrione. Gli studi hanno anche dimostrato che la tensione corticale dell’ovocita è polarizzata rispetto al fuso meiotico66; Pertanto, abbiamo avuto cura di misurare l’estremità dell’embrione di fronte al corpo polare, che di solito è vicino al fuso.
Micropipette per misurare embrioni di topo aveva 40-μm diametro interno (Origio MBB-FP-L-15); quelli per gli embrioni umani aveva 70-μ diametro interno e sono stati personalizzati da Origio. Una pressione di mantenimento di -0,03 p.s.i. viene applicata per tenere l’embrione e sigillare l’apertura della pipetta. Poi, una pressione di passo di -0,345 p.s.i. viene applicata all’embrione. La pressione desiderata viene applicata utilizzando un sistema di controllo PID ad anello chiuso. Un attuatore lineare (Firgelli L12) muove il tappo di una siringa da 1 ml, e un sensore (Honeywell SSCSNBN010NDAA5) misura la pressione. Questi sono collegati a un computer tramite un microcontrollore Arduino Uno che può trasmettere le letture dei sensori e dare comandi all’attuatore in tempo reale. Un video dell’aspirazione è registrato a 75 f.p.s. usando una telecamera CMOS (Thorlabs DCC1545M). Tutto l’hardware è controllato utilizzando il software Labview fatto su misura (National Instruments). Un programma automatico su misura Matlab (Mathworks) è stato utilizzato per estrarre la profondità di aspirazione dell’embrione e adattarlo ad un modello meccanico. Rilevamento del bordo Canny e la soglia sono stati utilizzati per identificare angolo pipetta e l’apertura. Cross-correlazione basata sul modello di corrispondenza è stato utilizzato per tracciare automaticamente bordo embrione nel tempo per rimuovere bias da misurazioni manuali. Durante la misurazione dei parametri meccanici dell’embrione, lo sperimentatore era in cieco se sono sopravvissuti allo stadio di blastocisti o meno, o a quale gruppo appartenevano (nel caso degli esperimenti di microiniezione).
Modello meccanico di embrioni monocellulari
Un modello solido elastico lineare modificato (modello Zener modificato) è stato utilizzato per rappresentare l’embrione come è stato aspirato nella micropipetta. Assumendo un input a gradino per la forza applicata all’embrione, l’equazione per la profondità di aspirazione nel tempo è:
Dove
Il modello Zener modificato è stato scelto rispetto ad altri modelli viscoelastici comunemente usati come il Maxwell, Kelvin-Voigt e Zener (Standard Linear Solid) in base all’ispezione visiva delle dinamiche di risposta. Abbiamo osservato nei nostri esperimenti che la risposta di un embrione ad un input di pressione di passo era un allungamento istantaneo seguito da un componente di decadimento esponenziale (invertito in modo che la deformazione è aumentato nel tempo), infine seguita da deformazione ad un tasso costante come mostrato in Fig. 2c.
Un corpo Maxwell consiste di una molla e dashpot in serie, quindi, la sua risposta ad una pressione di passo è un allungamento istantaneo seguito da una deformazione lineare costante. Poiché i nostri dati hanno mostrato una chiara componente esponenziale, questo modello è stato ritenuto insufficiente per descrivere il nostro sistema. Un corpo di Kelvin-Voigt è costituito da una molla e un dashpot in parallelo; quindi, la sua risposta a una pressione di passo è un esponenziale decadente in cui la profondità di aspirazione si stabilisce su una profondità massima finale. Questo modello non riesce a catturare l’allungamento istantaneo sperimentato dall’embrione così come il tasso lineare di deformazione dopo che la componente esponenziale si assesta. Il modello Zener aggiunge una molla extra in parallelo al corpo Maxwell e la sua risposta alla pressione è simile a quella di un corpo Kelvin-Voigt, ma con un allungamento istantaneo quando la pressione viene applicata per la prima volta. Ancora, questo modello ha richiesto l’aggiunta di un dashpot extra in serie con le altre tre componenti per catturare accuratamente la deformazione lineare sperimentata dall’embrione dopo che la componente esponenziale si è assestata.
Un confronto dell’errore di adattamento per cinque diversi modelli è mostrato nella Fig. 10 supplementare. Il nostro modello (che ha 4 parametri) sembra appropriato perché il suo errore è quasi basso come l’errore del modello a cinque parametri, con o senza l’inutile parametro extra. Crediamo quindi che il nostro modello descriva accuratamente i dati senza overfitting.
Valutazione della vitalità embrionale e dei parametri del ciclo cellulare
La formazione di blastocisti è stata utilizzata come proxy per la vitalità durante la costruzione di un classificatore per distinguere tra embrioni vitali e non vitali basati sulla meccanica. Questo classificatore è stato convalidato nel topo come mostrato dagli esperimenti di nascita viva in Fig. 2. Dopo i parametri meccanici embrione sono stati misurati il giorno 1, gli embrioni sono stati coltivati per 5-6 giorni all’interno del sistema Auxogyn Eeva, con fotogrammi catturati ogni 5 min. I parametri del ciclo cellulare27 sono stati estratti dai video risultanti, e gli embrioni che formano blastocisti entro il giorno 5 (topo) o il giorno 6 (umano) sono stati classificati come vitali.
Previsione della vitalità embrionale
La sopravvivenza delle blastocisti è stata utilizzata come informazione di verità di base per la formazione di un classificatore per prevedere la vitalità embrionale basata su misure meccaniche del giorno 1. Un classificatore SVM binario con un kernel RBF è stato addestrato sui parametri meccanici dell’embrione. I valori ottimali per il vincolo della scatola (c) e il sigma RBF (σ) sono stati scelti utilizzando 10 volte la convalida incrociata. Una volta determinati i parametri SVM ottimali, sono state eseguite 100 simulazioni Monte Carlo di convalida incrociata di 10 volte per calcolare l’area media sotto la curva ROC e la curva PR.
Poiché sono stati misurati un totale di quattro parametri meccanici per ogni embrione, è stata condotta una selezione avanzata delle caratteristiche per determinare il numero ottimale di parametri da includere nel nostro classificatore di vitalità. I risultati di questo processo sono mostrati nella Fig. 2C supplementare, dimostrando che c’è un grande miglioramento quando si usano due parametri invece di uno, e un leggero miglioramento quando si aggiunge un terzo parametro. L’utilizzo di tutti e quattro i parametri riduce l’efficacia del nostro classificatore perché il quarto parametro non è utile per separare gli embrioni in base alla vitalità, ma aggiunge una dimensione extra ai dati.
Per condurre la selezione delle caratteristiche in avanti, prima ogni parametro è stato utilizzato da solo per separare gli embrioni ed è stato trovato un classificatore ottimale. Come descritto sopra, è stata condotta una validazione incrociata di 10 volte per stimare l’area sotto la curva ROC per quel parametro. Una volta scelto il parametro con il più alto valore predittivo, un nuovo classificatore è stato addestrato e ottimizzato utilizzando ciascuno dei parametri rimanenti. Il parametro che ha causato il più alto miglioramento del valore predittivo è stato aggiunto al classificatore, e il processo è stato ripetuto fino a quando non c’erano parametri rimanenti.
Per gli esperimenti sul rilascio dei granuli corticali, le figure sono state mostrate utilizzando solo il parametro più predittivo di vitalità (rigidità, k1) per semplicità. Il classificatore a tre parametri, precedentemente addestrato, è stato utilizzato per ordinare gli embrioni in base alla vitalità, ma abbiamo determinato che le figure sono più chiare quando si utilizza solo la rigidità.
Esperimenti di nascita viva del topo
I topi femmina CD1 sono stati acquistati dal Jackson Laboratory e accoppiati con maschi vasectomizzati per servire come destinatari pseudopregnanti. I topi sono stati tenuti nelle stesse condizioni di quelli utilizzati per la raccolta degli embrioni. I parametri meccanici degli embrioni raccolti da (C57B6xDBA2) topi F1 sono stati misurati e gli embrioni sono stati ordinati in gruppi vitali o non vitali in base a questi parametri. In ogni esperimento, un numero uguale di embrioni di topo stadio di una cellula (gamma da 10 a 15) sono stati trasferiti nell’ovidotto di un destinatario embrione recentemente tappato. Questo esperimento è stato ripetuto quattro volte (Tabella 1 supplementare) con 10-15 embrioni trasferiti ad ogni mouse in ogni esperimento. Il tecnico che trasferisce gli embrioni era cieco a quali embrioni erano in quale gruppo. Lo stesso numero di embrioni allo stesso stadio di sviluppo sono stati scelti a caso e trasferiti a topi pseudopregnanti come controllo. I cuccioli erano attesi il giorno 20 dopo l’intervento. Un test χ2 è stato eseguito per verificare se la differenza nel numero di cuccioli nati in ogni gruppo (vitale, non vitale o di controllo) era statisticamente significativo.
RNA-seq preparazione del campione
Due esperimenti separati sono stati condotti con un totale di 32 embrioni umani 2PN per ottenere campioni per RNA-seq. Gli embrioni sono stati lasciati recuperare per 3-4 ore in mezzi di coltura dopo lo scongelamento e sono stati misurati i parametri meccanici. Ogni embrione è stato classificato come vitale o non vitale in base ai suoi parametri meccanici. cDNA da ogni embrione è stato sintetizzato da RNA totale utilizzando il kit SMARTer Ultra Low RNA (Clontech) secondo il protocollo del fornitore. Dopo la tosatura Covaris di cDNA full-length, librerie finali sono stati generati utilizzando il NEBNext DNA Sample Prep Master Mix Set (New England Biolabs) e sottoposti a controllo di qualità con un bioanalizzatore Agilent 2100. I campioni risultanti sono stati poi presentati per singola cella RNA-seq su una piattaforma Illumina HiSeq 2000 utilizzando il 100-bp paired-end strategia di sequenziamento.
Su 25 embrioni scelti per il sequenziamento, tre embrioni sono stati esclusi a causa di difficoltà tecniche (nessun RNA recuperato). Abbiamo presentato un totale di 22 embrioni per il sequenziamento, che sono stati classificati come vitali o non vitali in base ai parametri meccanici.
RNA-seq data processing
Il sequenziamento ha restituito ∼1 miliardo di letture paired-end di lunghezza 101 appartenenti a 22 embrioni totali. I dati di sequenza grezzi in formato fastq sono stati passati attraverso il controllo di qualità per rimuovere le chiamate di base di bassa qualità e le sequenze adattatore (FastX trimmer e clipper). Le sequenze filtrate sono state poi allineate al genoma umano di riferimento (hg18) con lo strumento STAR aligner67 su un computer. I file .bam risultanti sono stati filtrati per la qualità dell’allineamento, ordinati e i duplicati PCR rimossi (SAMtools sort e rmdup). I conteggi per gene sono stati poi calcolati usando HTSeq-count68 e confrontando le letture allineate con il trascrittoma umano di riferimento.
Per tenere conto di possibili effetti di lotto derivanti dalla variazione biologica tra i pazienti, diversi protocolli di congelamento, mezzi di coltura o altri fattori, abbiamo dovuto determinare quali embrioni provenivano da quali pazienti. Abbiamo analizzato le varianti di sequenza nei trascrittomi di ogni embrione, ed eseguito il clustering gerarchico sulle varianti per le quali avevamo una buona copertura di sequenziamento (Fig. 11 supplementare). Abbiamo determinato che dei 22 embrioni sequenziati, 17 avevano embrioni “fratelli”, mentre 5 erano gli unici embrioni dei rispettivi pazienti. Abbiamo escluso questi cinque, e quindi utilizzato la funzione ComBat nel pacchetto sva69,70 in R per rimuovere gli effetti batch dai dati RNA-seq dai restanti 17 embrioni. Anche se escludere i cinque embrioni senza fratelli può aver distorto i nostri risultati, sarebbe stato impossibile stimare la variazione biologica all’interno di questi pazienti utilizzando solo un campione e quindi abbiamo dovuto escluderli. Dopo la rimozione di questi effetti di lotto, i nostri dati riflettevano le differenze nelle trascrizioni ereditate dalla madre tra gli embrioni vitali e non vitali coerenti in tutti i pazienti. L’analisi di espressione differenziale è stata condotta sui dati aggiustati utilizzando il pacchetto R edgeR28. I geni con q-valori (valori P aggiustati con il metodo Benjamini-Hochberg) inferiori a 0,01 sono stati classificati come statisticamente significativi.
Ontologia genica e analisi di rete
L’elenco dei geni DE con q-valori<0,01 è stato passato nello strumento DAVID (NCBI), e il clustering è stato eseguito con termini ontologici relativi a BPs e funzioni molecolari (MFs). I cluster con almeno un termine con un valore P aggiustato<0.05 sono stati considerati statisticamente significativi e inclusi nella tabella 1. I termini all’interno di ogni cluster sono stati combinati in una singola frase descrittiva e inclusi nella Tabella 1. Ulteriori analisi ontologia genica è stata condotta con il goseq e GO.db pacchetti in R. Tutte le categorie ontologia genica con almeno 10 geni sono stati classificati in ordine della percentuale di geni DE all’interno di quella categoria, e confrontato con la proporzione di geni DE in tutte le categorie.
IPA è stato utilizzato per analizzare l’elenco dei geni DE insieme con il log-fold cambiamento tra embrioni vitali e non vitali. Un’analisi del nucleo è stata condotta per trovare i processi cellulari che si prevedevano essere significativamente aumentati o diminuiti sulla base dei cambiamenti di espressione genica, nonché le reti di geni che sono stati regolati come gruppo.
Macchiatura dei granuli corticali
I parametri meccanici degli embrioni di topi B6 e degli embrioni da FIV (da topi CBA) sono stati misurati allo stadio zigote in due esperimenti separati. Gli embrioni sono stati classificati come vitali o non vitali in base ai loro parametri meccanici, e poi ZP è stato rimosso esponendo brevemente gli embrioni alla soluzione di Tyrode (Sigma) seguita da tre lavaggi in PBS (Invitrogen). Gli embrioni denudati sono stati poi fissati in paraformaldeide 4% per 20 minuti a temperatura ambiente e colorati con fluoresceina isotiocianato marcato anticorpo Lectin (Sigma) e 4,6-diamidino-2-fenilindolo. Un microscopio confocale a scansione laser Zeiss LSM510 è stato utilizzato per la visualizzazione e l’acquisizione delle immagini.
L’elaborazione delle immagini confocali
Le pile di immagini grezze sono state convertite in formato TIFF e sono stati scritti script Matlab personalizzati per estrarre i parametri delle immagini. La regolazione del contrasto è stata effettuata su tutte le immagini di ogni stack per tenere conto della perdita di segnale a profondità di imaging maggiore, e un’immagine di proiezione è stata calcolata per ogni stack. Il citoplasma di ogni cellula è stato isolato eseguendo la sogliatura automatica con il metodo di Otsu, il rilevamento dei bordi Canny e una trasformazione di Hough circolare per rilevare la posizione e le dimensioni di ogni cellula. Un profilo di intensità è stato calcolato lungo un percorso intorno alla circonferenza di ogni cellula, al 95% del raggio della cellula e con una larghezza del 10% del raggio della cellula. I parametri tracciati nell’immagine 4 erano (a) la media e (b) la s.d. di questo profilo di intensità. Il ricercatore era cieco ai parametri meccanici di ogni embrione e al gruppo (nel caso degli esperimenti di microiniezione) mentre misurava i parametri dei granuli corticali.
Test statistici
Un test χ2 è stato utilizzato per verificare se la proporzione di embrioni che risultava in un parto vivo (sezione 2.2) era significativamente diversa tra i tre gruppi sperimentali (previsto vitale basato sulla meccanica, previsto non vitale basato sulla meccanica e controllo-selezionato solo dalla morfologia). L’unica assunzione fatta da questo test è che nessun gruppo (un `gruppo’ si riferisce sia agli embrioni che risultano in un parto vivo, sia agli embrioni che non risultano in un parto vivo) contenga meno di cinque campioni. Questa assunzione è soddisfatta per entrambi i confronti che sono stati eseguiti (vitale contro controllo, vitale contro non vitale).
Per determinare i geni con differenze significative di espressione tra embrioni umani vitali e non vitali, sono stati utilizzati i pacchetti sva e edgeR in R. Questi pacchetti sono stati ben convalidati per l’uso nella rimozione degli effetti di lotto e la determinazione di differenze significative di espressione per i dati RNA-seq.
Un test di somma di rango Wilcoxon è stato utilizzato per confrontare la luminosità dei granuli corticali tra gli embrioni (un t-test non è stato utilizzato perché i campioni avevano un numero basso e non erano normalmente distribuiti secondo il test di Lilliefors). Per determinare se l’iniezione dell’anticorpo IP3 ha cambiato la rigidità media dell’embrione, è stato utilizzato un test t a due facce perché i gruppi iniettati con l’anticorpo e il controllo sono stati determinati per essere normalmente distribuiti utilizzando il test di Lilliefors. Un test Kolmogorov-Smirnov a due campioni è stato utilizzato per dimostrare che l’iniezione dell’anticorpo ha causato un cambiamento significativo nella distribuzione dei valori di rigidità. I test di somma di rango Wilcoxon sono stati utilizzati per confrontare le differenze tra i quartili dei gruppi iniettati con l’anticorpo e quelli iniettati con il controllo perché c’erano pochissimi campioni in ogni quartile. Wilcoxon rank sum test sono stati utilizzati anche per testare la differenza nei valori mediani della rigidità degli ovociti tra gli stadi GV, MI e MII perché i valori di rigidità non soddisfacevano i criteri di normalità.