Disbiosi intestinale precoce legata alla mortalità giovanile negli struzzi

Mortalità e disbiosi in diverse regioni intestinali durante l’ontogenesi

La mortalità degli struzzi giovanili si è verificata per tutto il periodo di studio di 12 settimane ma è stata più alta tra le 4 e le 8 settimane di età, con un picco a 6 settimane (Fig. 1b). Gli individui affetti da malattia hanno seguito la curva di crescita di tutti gli altri individui prima di scendere rapidamente di peso prima della morte (Fig. 1c, d). La causa della riduzione di peso è sconosciuta, ma gli individui malati sono stati osservati smettere di mangiare e bere, e in alcuni casi hanno sofferto di diarrea, quindi disidratazione e spreco sono spiegazioni probabili. In totale, il 40% di tutti i pulcini è morto per sospetta malattia (68/170, esclusi 60 controlli e 4 individui feriti). Le autopsie degli individui malati e di controllo hanno rivelato che la mortalità era associata a un’estesa infiammazione del tratto gastrointestinale (Fig. 1e; Figura S1). I punteggi di infiammazione intestinale di individui malati (media ± SD per ileo = 3.1 ± 1.0, cieco = 2.0 ± 1.3, colon = 2.0 ± 1.2) erano sostanzialmente superiori a quelli degli individui di controllo (ileo = 0.4 ± 1.0, cieco = 0.04 ± 0,29, colon = 0,08 ± 0,45) (Figura S1).

La struttura del microbiota degli individui malati e di controllo era estremamente diversa in tutte e tre le regioni intestinali (Fig. 2, Figura S2, Tabella 1). In particolare, c’erano differenze significative nelle distanze della comunità microbica (ottenute con entrambe le misure Bray-Curtis (BC) e UniFrac pesato (wUF)) tra individui malati e di controllo, controllando per età, sesso, gruppo e tempo dalla morte (Tabella 1). Tuttavia, le misure Bray-Curtis e UniFrac pesato hanno rivelato modelli contrastanti: Le distanze di Bray-Curtis sono state più grandi nell’ileo che diminuisce verso l’intestino inferiore (cieco-colon), mentre le misure ponderate UniFrac sono state più grandi nel colon che diminuisce verso l’ileo (Tabella 1). Sesso, gruppo e tempo dalla morte non hanno avuto effetti significativi su nessuna delle misure di distanza del microbioma in nessuna delle regioni intestinali (Tabella 1).

Grandi differenze sono state trovate anche quando si esamina la variazione nei microbiomi tra gli individui malati rispetto alla variazione tra gli individui di controllo. Gli individui malati erano più simili tra loro nel microbioma ileale che i controlli erano tra loro quando si utilizza Bray-Curtis, ma non ponderata UniFrac distanze (BC Multivariate omogeneità test di dispersione di gruppo (betadisper): F1, 99 = 13.9, p = 0.0003. wUF betadisper: F1, 99 = 0.6, p = 0.46) (Figure S3-S4). Al contrario, il contrario era vero nel cieco e nel colon (BC cecum betadisper: F1, 105 = 0.08, p = 0.79. BC colon betadisper: F1, 106 = 1.3, p = 0.25. wUF cecum betadisper: F1, 105 = 11.2, p = 0.001. wUF colon betadisper: F1, 106 = 11.4, p = 0.001) (Figura S3). Insieme, questi risultati mostrano che la composizione batterica degli individui malati e di controllo differiva maggiormente nell’ileo, ma che il colon conteneva i gruppi più filogeneticamente distinti.

Diversità alfa e disbiosi specifica dell’età in diverse regioni dell’intestino

La diversità microbica alfa di individui malati era notevolmente ridotta in tutte e tre le regioni dell’intestino rispetto ai controlli (GLMs malattia: ileo F1, 99 = 56.7, p = 2.5e-11; cieco F1, 105 = 16.1, p = 0.0001; colon F1, 106 = 61.5, p = 3.9e-12), controllando per età (Fig. 3). Nell’ileo, le differenze persistevano in tutte le età (GLM malattia * età: F1, 97 = 0.0001, p = 0.99), e c’erano pochi effetti di età, anche in individui sani (GLM età: F1, 98 = 1.4, p = 0.23). Nell’intestino cieco e nel colon, gli individui malati avevano una diversità alfa più bassa rispetto ai controlli alle prime età (Tabella 1; Fig. 3), ma queste differenze sono diminuite con l’età come diversità generalmente aumentata in tutti gli individui (GLM malattia * età: cieco F1, 103 = 10.2, p = 0.002; colon F1, 104 = 9.1, p = 0.003). Riduzioni nella diversità alfa associati con la malattia erano quindi evidente in tutto l’intestino alle prime età, ma sono stati limitati alla ileo in età più avanzata (vedi anche ).

Taxa associati alla malattia nell’ileo

Per comprendere meglio le dissimilarità microbiche tra individui malati e di controllo, abbiamo valutato la composizione tassonomica di tutte le regioni gastrointestinali. L’ileo ha mostrato la prova più evidente di disbiosi (Fig. 4). Gli individui di controllo avevano una comunità diversificata di diverse classi batteriche nell’ileo, mentre gli individui malati mostravano una fioritura di Gammaproteobatteri e una grande riduzione di Bacilli e altre classi più rare. Un’indagine dettagliata delle famiglie appartenenti ai Gammaproteobatteri ha mostrato una dominanza quasi completa delle Enterobacteriaceae nei campioni di ileo malato, mentre gli individui di controllo ospitavano una serie diversificata di famiglie di Gammaproteobatteri (Figura S5).

Le Enterobacteriaceae Gram-negative sono una grande famiglia che è ben nota per comprendere diversi patogeni intestinali e patogeni, ed è spesso visto in abbondanze più elevate negli ospiti con disbiosi intestinale. C’erano 19 unità tassonomiche operative (OTU; sequenze con il 100% di identità nucleotidica) associate alle Enterobacteriaceae nell’ileo, e le ricerche blast contro il database nucleotidico NCBI corrispondevano a una vasta gamma di generi, tra cui Escherichia, Klebsiella, Shigella, Salmonella, Yokenella, Citrobacter, Enterobacter, Cronobacter, Atlantibacter, Pluralibacter, Leclercia e Kluyvera. In studi precedenti, è stato dimostrato che vari membri della famiglia delle Enterobacteriaceae spesso co-occorrono e fioriscono simultaneamente durante la disbiosi, il che è coerente con i nostri risultati.

Un’altra caratteristica chiave della disbiosi nell’ileo era che alcuni individui avevano microbiomi quasi interamente composti da Clostridi, un modello non osservato in nessun individuo di controllo (Figura 4). Le famiglie di Clostridi hanno mostrato ulteriori modelli tassonomici sorprendenti negli individui malati, tra cui un aumento importante di Peptostreptococcaceae e una marcata riduzione di Ruminococcaceae e altre famiglie rare (Figura S5). La famiglia Peptostreptococcaceae era rappresentata da sei OTU nei nostri dati, e le ricerche di blast hanno prodotto corrispondenze con varie specie di Paeniclostridium, Paraclostridium e Clostridium. La più prevalente di queste OTU corrispondeva al Paeniclostridium sordellii, un batterio noto per avere ceppi virulenti che causano alta morbilità e mortalità attraverso enterite ed enterotossiemia sia nell’uomo che negli animali. Trentotto OTU sono stati significativamente sovrarappresentati nell’ileo di individui malati (Fig. 5), di cui la maggior parte apparteneva ai Clostridi, tra cui Ruminococcaceae, vari Clostridium spp, ed Epulopiscium, ma anche Bacteroides, Escherichia, e Bilophila wadsworthia (Tabella S1).

Taxa associati alla malattia nel cieco e nel colon

Esaminando le abbondanze relative delle classi batteriche nel cieco e nel colon si è visto che gli individui di controllo erano in gran parte simili, esibendo una composizione del microbioma relativamente stabile tra gli ospiti e le età. Tuttavia, c’erano grandi interruzioni nella composizione microbica di entrambe le regioni intestinali in individui malati (Fig. 4). Simile all’ileo, i Gammaproteobatteri erano più prevalenti nel cieco e nel colon degli individui malati, ma una riduzione dei Clostridi e un aumento dei Bacteroidi costituivano le differenze più importanti. Ulteriori analisi tassonomiche dei Bacteroidia hanno mostrato che la famiglia Porphyromonadaceae aveva proliferato nel cieco e nel colon degli individui malati (Figura S5). Questa famiglia comprendeva due specie nei nostri dati, Parabacteroides distasonis e Dysgonomonas sp., che si trovano comunemente nel microbiota intestinale normale. Tuttavia, P. distasonis è stato precedentemente identificato come una specie che promuove la colite nei topi e i membri di Dysgonomonas sono noti per essere associati a cachessia e infiammazione intestinale.

I test di abbondanza differenziale hanno identificato grandi somiglianze nei modelli di disbiosi dell’intestino cieco e del colon, poiché 50 dei 56 (89%) OTU che erano più abbondanti nei campioni di colon malato erano anche più abbondanti nei campioni cecali malati (Fig. 5; Tabelle S2-S3). Inoltre, 15 di queste OTU (39%) erano anche significativamente sovrarappresentate nell’ileo (Tabella S1). La OTU più significativa nel cieco (q = 1.2e-53) e nel colon (q = 2.4e-56) era assente negli individui di controllo ma abbondante negli individui malati (Tabelle S2-S3). Questo OTU, che era anche altamente significativo nell’ileo (q = 3.4e-21), aveva una corrispondenza del 100% contro Clostridium paraputrificum, un noto patogeno umano associato a sepsi ed enterocolite necrotizzante. C. paraputrificum è stato anche studiato sperimentalmente nelle quaglie gnotobiotiche, dove ha causato lesioni ed emorragie nel rivestimento dell’intestino associate a enterocolite.

Oltre a C. paraputrificum, OTU altamente significative che erano più abbondanti negli individui malati (Tabelle S2-S3) hanno dato corrispondenze in esplosione (99.5-100% di identità) alle specie di Clostridium C. colinum, C. cadaveris, C. butyricum e C. perfringens, che sono state tutte precedentemente collegate all’enterocolite acuta sia negli struzzi che in altri animali. Altre OTU che erano altamente sovrarappresentate nei campioni cecali e del colon malati appartenevano alle Enterobacteriaceae, Ruminococcaceae, Mogibacteriaceae, Bacteroides, Dorea, Sedimentibacter, Bilophila wadsworthia, e Eggerthella lenta (Fig. 5; Tabelle S2-S3). Molti di questi batteri fanno parte del normale microbiota intestinale e la maggior parte di tutte le OTU significativamente sovrarappresentate negli individui malati erano presenti anche in alcuni individui di controllo, anche se con abbondanze molto più basse (Tabelle S2-S3).

Tassi associati alla salute in diverse regioni intestinali

L’ileo degli individui malati ha mostrato grandi riduzioni di alcuni batteri rispetto ai controlli (Fig. 4), soprattutto Bacilli, una classe in cui Turicibacteraceae e Lactobacillaceae erano le famiglie più comuni. Turicibacteraceae includeva due OTU significative di Turicibacter (Tabella S1), che hanno mostrato abbondanze diminuite nell’ileo malato. Turicibacter ha dimostrato di essere altamente ereditabile negli esseri umani e nei topi dove è in contatto diretto con le cellule ospiti dell’intestino tenue. Questo genere è stato associato sia alla salute che alla malattia, ma è spesso trovato impoverito negli animali con diarrea ed enteropatia.

Una delle differenze più sorprendenti sia nel cieco che nel colon degli individui malati era una riduzione sostanziale della famiglia Bacteroidia, S24-7 (Figura S5). Poco si sa di S24-7, nonostante sia un componente di spicco del normale microbiota intestinale dei vertebrati. Tuttavia, gli studi sui topi hanno riportato un effetto potenzialmente benefico di S24-7, con abbondanze spesso ridotto in ospiti malati. La maggior parte delle OTU con abbondanze ridotte nel colon di individui malati erano anche sottorappresentati nel cieco (15 su 19; 79%), indicando esaurimento su larga scala di batteri potenzialmente associati alla salute in tutto il hindgut. Queste OTU appartenevano a taxa come Lachnospiraceae (ad esempio, Coprococcus, Blautia), Ruminococcaceae (ad esempio, Ruminococcus), S24-7, Erysipelotrichaceae, Clostridium, Anaeroplasma, Turicibacter, Methanobrevibacter, Akkermansia muciniphila, e diversi Clostridiales sconosciuti (Fig. 5; Tabelle S2-S3). Questa OTU corrispondeva al genere Roseburia, produttore di butirrato, che è stato ripetutamente associato alla salute. Per esempio, abbondanze inferiori di Roseburia spp. sono state scoperte negli esseri umani con colite ulcerosa, malattia infiammatoria intestinale, sindrome dell’intestino irritabile, obesità, encefalopatia epatica e diabete di tipo 2, e nei maiali con dissenteria suina. Questi risultati supportano l’idea che Roseburia e molti altri taxa precedentemente trovati per essere associati negativamente alla malattia, non sono solo specifici dei modelli di disbiosi dei mammiferi, ma la loro deplezione è una caratteristica unificante della disbiosi attraverso ospiti filogeneticamente distanti come gli esseri umani e gli struzzi.

Distruzione del microbiota intestinale nelle settimane precedenti la morte

Per stabilire se la disbiosi si verifica immediatamente prima della morte o deriva da squilibri che emergono prima nella vita, abbiamo esaminato il microbiota di campioni fecali che sono stati ripetutamente raccolti prima della morte. Abbiamo trovato che la sopravvivenza del pulcino fino a 4 settimane di età non era legata alla diversità alfa o filogenetica dei batteri prima nella vita (Tabella S4). Tuttavia, la probabilità di sopravvivere oltre sei settimane è stata prevista da una maggiore diversità alfa a 2 settimane di età (Cox’s hazard ratio (HR): 0.57±0.25, p < 0.05), ma minore diversità alfa a 4 settimane di età (HR: 4,02±0,59, p < 0,05), e minore diversità filogenetica a due e quattro settimane di età (HR 2 settimane: 1,40±0,15, p < 0,05; HR 4 settimane: 1.88±0.24, p < 0.01) (Figura S6; Tabella S4). Questi risultati suggeriscono che gli individui con bassa diversità microbica alfa a 2 settimane di età erano suscettibili di colonizzazione con distinti gruppi filogenetici di batteri, che ha aumentato il loro rischio di mortalità nelle settimane successive.

In seguito, abbiamo esaminato se le abbondanze di famiglie batteriche che differivano tra gli individui malati e di controllo potrebbe predire modelli di mortalità futura nelle settimane precedenti la morte. C’era solo una debole evidenza che avere abbondanze più elevate di Lactobacillaceae a 2 settimane di età e Turicibacteraceae a 4 settimane di età aveva una tendenza a influenzare positivamente la sopravvivenza (Figura S7; Tabella S4). Le abbondanze di Peptostreptococcaceae e S24-7 oltre le 6 settimane di età erano anche associate a una maggiore sopravvivenza successiva, anche se non in modo significativo (Tabella S4). Tuttavia, ci sono state associazioni molto forti tra le abbondanze di Peptostreptococcaceae e S24-7 durante la prima settimana di vita e la mortalità in tutte le età successive, anche dopo aver controllato le abbondanze di queste famiglie batteriche in età successive (Peptostreptococcaceae HR range: 1,65±0,13 a 1,73±0,16, tutti i valori di p < 0,001; S24-7 HR range: 1,24±0,11 a 1,60±0,21, tutti i valori di p < 0,05) (Fig. 6; Tabella S4). Questo risultato suggerisce che i tempi di proliferazione di alcuni gruppi batterici, come Peptostreptococcaceae e S24-7, può essere la chiave per la fitness dell’ospite con abbondanze più elevate durante le prime età potenzialmente avere effetti negativi anche se gli stessi gruppi batterici potrebbe essere benefico in età successive. Ciò supporta ulteriormente la nozione che i primi due giorni dopo la schiusa sono un periodo critico che determina se si verificano squilibri microbici, che possono portare ad un aumento della mortalità anche mesi dopo.

Fonti ambientali di batteri intestinali

Infine, abbiamo valutato le potenziali fonti ambientali dei microbi presenti nell’intestino di individui di controllo e malati. I campioni sono stati raccolti da acqua, cibo e substrato del suolo durante il periodo di studio e analizzati con SourceTracker . Non c’era essenzialmente alcun contributo dalla fornitura di acqua (0.1-0.4%) o dal suolo (0.2-0.7%) al microbiota intestinale di entrambi gli individui malati o di controllo (Fig. 7). Invece, la maggior parte dei batteri intestinali provenivano da fonti sconosciute (89.9%). Alcune sequenze microbiche presenti nel cibo si sono sovrapposte a OTU trovate nell’ileo e nel colon. Tuttavia, questi erano prevalentemente in individui di controllo, il che può essere spiegato da individui sani che mangiano più di individui malati (Fig. 7). Questi risultati indicano che il cibo o l’acqua contaminati erano fonti improbabili di batteri associati alla mortalità.

Il nostro schema di campionamento ambientale non esclude la possibilità che ci siano altre fonti ambientali di batteri patogeni. Per esempio, diverse specie di uccelli selvatici, tra cui passeri del capo, tessitori del capo, tessitori mascherati, alfieri rossi e quelea sono stati spesso osservati nei recinti esterni dei pulcini. Il campionamento di acqua, cibo e suolo ogni 2 settimane potrebbe anche non essere stato abbastanza frequente per rilevare la potenziale presenza transitoria di batteri nell’ambiente o eventi di trasmissione che possono verificarsi sporadicamente. Tuttavia, le nostre analisi longitudinali del microbioma fecale suggeriscono che i problemi di disbiosi sorgono all’inizio della vita da taxa già presenti nell’intestino, piuttosto che l’acquisizione improvvisa di nuovi taxa. Si sa poco sui microbiomi delle uova, dei genitori o dell’ambiente di cova per questa specie, ma questa è una strada ovvia per la ricerca futura che può aiutare a identificare i modi per controllare la prevalenza di batteri problematici durante la prima vita. Per questo studio, i pulcini sono stati allevati in isolamento dagli adulti perché facilita la gestione e la manipolazione. Tuttavia, questo approccio impedisce le interazioni tra pulcini e genitori che possono essere importanti per l’istituzione precoce del microbiota intestinale. Per esempio, la coprofagia (alimentazione con feci) ha dimostrato di essere importante nello sviluppo del microbiota in altri animali e i pulcini di struzzo sono noti per essere coprofagi. Fornire l’accesso agli adulti (o almeno le loro feci) può consentire ai pulcini di seminare il loro microbioma all’inizio della vita con una comunità batterica equilibrata e diversificata, possibilmente prevenendo la futura proliferazione di batteri problematici. Questa idea, tuttavia, rimane da testare sperimentalmente.