Batteri che prendono forma: Genetic Determinants of E. coli Morphology

Osservazione

Le forme delle cellule batteriche rappresentano miliardi di anni di perfezionamento evolutivo. Le loro piccole dimensioni si traducono in alti rapporti superficie-volume, che sono ideali per il trasporto dei nutrienti, la respirazione efficiente e il mantenimento dell’integrità strutturale. È noto che la forma complessiva delle cellule è governata da una serie di processi cellulari e di spunti ambientali (1-3). Diventa rapidamente impegnativo, tuttavia, individuare il modo in cui le variazioni di forma hanno un impatto sulla funzione cellulare. I dati su scala genomica che descrivono i contributi genetici alla morfologia batterica sono un passo avanti nell’affrontare questa domanda. Inoltre, le reti di interazione risultanti rappresentano più reti biologiche collegate derivanti da diversi fenotipi di forma. Qui, descriviamo un’istantanea genomica della morfologia di Escherichia coli K-12 nella fase medio-esponenziale utilizzando la collezione di delezioni Keio (4). Abbiamo ulteriormente caratterizzare le interazioni genetiche tra delezioni impatto forma e il genoma E. coli utilizzando coniugazione high-throughput (5, 6).

La piattaforma di imaging ad alto contenuto che abbiamo sviluppato è altamente su misura per il compito complicato di imaging batterico. Tempi di imaging per alta densità (384- o 1.536-pozzetti) piastre microwell può superare di gran lunga il tempo di raddoppio di circa 20 minuti per E. coli, presentando sfide temporali per l’imaging librerie genomiche all’interno di una fase comune di crescita. Inoltre, la motilità delle cellule batteriche vive presenta ulteriori difficoltà nel limitare la mobilità delle cellule durante l’imaging microscopico. Abbiamo contrastato queste sfide utilizzando un fissativo glutaraldeide, un primo passo comune in preparazioni microscopia elettronica e noto per preservare la forma delle cellule con impatti trascurabili alla risoluzione della microscopia ottica (7). Le cellule sono state poi colorate negativamente in piastre di imaging fondo di vetro (0,17 mm di spessore) utilizzando nigrosina e delicatamente fissato a caldo con controllo dell’umidità, portando tutte le cellule ad un piano focale comune. Questo ha ovviato alla necessità di contrasto di fase, che era impraticabile a causa del cono di luce dall’anello di fase essere bloccato da bordi bene in 384-pozzetti e micropiastre a più alta densità. L’utilizzo di un campo luminoso permetteva di far passare più luce attraverso il campione, con conseguente esposizione più veloce e migliore accuratezza focale. Le piastre preparate in questo modo possono essere reimpostate indefinitamente, e la qualità dell’immagine non degrada con il tempo, facilitando l’imaging ad alto contenuto di campioni che sono stati fissati in una fase di crescita specifica. Le immagini risultanti visualizzare un intenso contrasto tra le cellule e lo sfondo, che è altamente auspicabile per l’imaging quantitativo (Fig. 1; completamente dettagliata nel testo S1 e Fig. S1 nel materiale supplementare). Dieci caratteristiche morfologiche sono state quantificate per knockout: area, perimetro, asse minimo ellisse, lunghezza minima Feret, asse maggiore ellisse, lunghezza maggiore Feret, circolarità, rotondità, aspect ratio, e solidità. Abbiamo poi fatto uso dell’analisi delle componenti principali (PCA) come analisi multiparametrica e mezzi di riduzione della dimensionalità (Fig. 1; Fig. S1). Questo ci ha dato un mezzo completamente imparziale di ordinamento fenotipico dopo l’acquisizione. Trattamenti di forma anormale sono stati rivelati adattando un ellissoide intorno al cluster di dati che rappresentano la morfologia wild-type nello spazio principale-componente e selezionando per quelli che cadono al di fuori di questa zona di cutoff. I confini x, y e z dell’ellissoide in ogni dimensione corrispondono a un cutoff di 3-standard-deviation nelle prime tre componenti principali.

In questo modo, abbiamo identificato circa 111 mutanti di delezione con difetti di forma (vedi Tabella S1 e Data Set S1 nel materiale supplementare). Il nostro approccio è stato convalidato con la conferma di diversi mutanti di forma noti, tra cui il mutante di delezione tatA, precedentemente dimostrato di essere lungo e incatenato a causa della localizzazione impropria di amidasi nel periplasma (8). Mutazioni in holD, che codifica la subunità ψ della DNA polimerasi III, sono note per causare morfologie filamentose in E. coli (9). Infatti, la replicazione del DNA ha una relazione sincrona con i processi di divisione cellulare (10, 11), con interruzioni nella DNA girasi che portano a cellule allungate con cromosomi singoli e senza setti (12). È interessante notare che la piridossina 5′-fosfato ossidasi, codificata da pdxH, genera piridossal 5′-fosfato (PLP) e ha causato uno spostamento verso cellule lunghe e occasionalmente incatenate. PLP è un cofattore chiave nella fornitura di d-alanina e d-glutammato per la sintesi dei peptidoglicani della parete cellulare (13), e i mutanti pdxH sono noti per avere un fenotipo filamentoso (14). Allo stesso modo, EnvC è un attivatore degli enzimi di rimodellamento della parete cellulare ed è noto per causare la crescita filamentosa (15), e RodZ è coinvolto nella formazione delle pareti laterali ed è noto per causare la morfologia sferica (16). Questi fenotipi sono stati tutti confermati nel nostro schermo. Sorprendentemente, 52 geni nella nostra lista codificano proteine non caratterizzate in E. coli, con molti che sono putative proteine di membrana esterna o citoplasmatica (Tabella S1). Così, la piattaforma di screening ad alto contenuto descritto identificato geni non essenziali coinvolti nel mantenimento della forma. Per caratterizzare ulteriormente e sondare i processi biologici che interagiscono con queste mutazioni, abbiamo optato per preparare un array di interazione genetica con un focus su questi geni forma.

In tutto, 60 delezioni corrispondenti ai difetti di forma più forti sono state scelte come geni di interrogazione in un array genetico sintetico, 7 dei quali non si coniugavano bene usando la metodologia di Côté et al. (17). Questo ha portato a 53 geni di forma di interesse dalla tabella S1 essere sistematicamente attraversato (5, 6) con la collezione Keio, generando 1,7 × 107 mutanti doppia delezione (vedi Data Set S2 nel materiale supplementare) e una rete sintetica interazione letale (vedi Fig. S3 nel materiale supplementare). Abbiamo notato che i mutanti con variazioni di forma più estreme (per esempio pdxH, rodZ, envC, e mutanti gpmM) non si sono accoppiati correttamente in condizioni convenzionali e richiesto accoppiamento a temperatura ambiente per un lungo periodo di tempo. Quando i geni alla base delle interazioni sintetiche letali sono stati arricchiti utilizzando i termini Gene Ontology (GO) per i processi biologici, i processi di trasporto e di ossido-riduzione erano sovrarappresentati (Fig. 2; Fig. S3). Questo si è basato su un istogramma di frequenza di occorrenza per ogni termine GO, con ontologie accessibili utilizzando EcoCyc (18) pathway-tools software (19). È interessante notare che il canale della membrana esterna TolC è presente con alta frequenza, implicando una relazione tra l’efficacia del sistema di efflusso dei farmaci (Acr, Mdt, Ent, Emr, e Mac) e la forma delle cellule. Il simpatore predetto YdjN, che si verifica più frequentemente, è ulteriormente implicato sia nel trasporto di l-cisteina che nella risposta allo stress ossidativo (20), processi biologici casualmente arricchiti in Fig. 2. Infatti, i geni coinvolti nei processi redox erano spesso legati alla respirazione, come nei casi di ytfG, napG, cydB, nrdD e nrdG. Questo è particolarmente curioso dato che la forma/curvatura della membrana gioca un ruolo nella funzione delle proteine associate alla membrana (21, 22), specialmente se si considerano le potenziali relazioni tra efficacia dei farmaci e respirazione cellulare (23, 24). C’è, tuttavia, una comprensione limitata del legame tra la forma delle cellule (o superficie) e la respirazione. Abbiamo assistito a una notevole preponderanza di interazioni dei geni della forma con quelli coinvolti nelle funzioni respiratorie. Per esempio, nel lavoro di Côté et al. (17), 82 geni dello stress da nutrienti sono stati incrociati con la collezione Keio e hanno prodotto meno di 200 interazioni letali sintetiche con i geni coinvolti nei processi redox, mentre al contrario, circa 800 tali interazioni sono state osservate per 53 geni che alterano la forma (Fig. 2).

Ricercando nella collezione Keio le delezioni geniche che risultano in difetti di forma, si è inaspettatamente prodotta una ricchezza di geni non caratterizzati. Collegare questi geni con i ruoli nella forma delle cellule può aiutare nella classificazione funzionale a valle, in particolare quando si profilano simultaneamente le loro interazioni genetiche. Nel complesso, i geni coinvolti nel mantenimento della forma sembrano essere intrinsecamente legati a processi biologici come il trasporto e l’ossidazione e la riduzione, ma è necessario un ulteriore lavoro per chiarire la natura delle interazioni osservate. Di particolare interesse è se le perturbazioni fisiche come la geometria dell’imballaggio o le variazioni di curvatura (21) accompagnano i difetti di forma. Tuttavia, la ricerca qui presentata espande la nostra comprensione della complicata biologia che definisce la forma batterica. Inoltre, la piattaforma di microscopia ad alto contenuto descritta qui è altamente modificabile per qualsiasi libreria genomica o chimica batterica.