De 1853 à 1860, Billroth a été assistant dans la clinique chirurgicale de Bernhard von Langenbeck à la Charité de Berlin. Il y est également l’apprenti de Carl Langenbuch. En 1860, Billroth accepte l’offre de l’université de Zurich de devenir titulaire de la chaire de chirurgie clinique et devient directeur de l’hôpital et de la clinique chirurgicale de Zurich. Le début de sa carrière en Suisse est peu prometteur : lors de son premier semestre d’enseignement, il n’a que dix étudiants, et il dit lui-même que les revenus qu’il tire de sa pratique privée ne suffisent pas à payer sa tasse de café du matin. Sa réputation grandit cependant rapidement ; Billroth a une personnalité contagieuse, qui attire dans ses rangs aussi bien les étudiants que les stagiaires en chirurgie. Ses étudiants l’adorent et il est un professeur efficace, tant pour les étudiants de premier cycle que pour les diplômés. Les étudiants affluaient à ses cours, et avec la coopération de collègues énergiques, il a pu élever la faculté de médecine de Zurich à une position de premier plan parmi les écoles germanophones en seulement quelques années.
Alors qu’il était à Zurich, Billroth a publié son manuel classique Die allgemeine chirurgische Pathologie und Therapie (Pathologie et thérapie chirurgicales générales) (1863). En même temps, il a introduit le concept d’audits, en publiant tous les résultats, bons et mauvais, ce qui a automatiquement entraîné une discussion honnête sur la morbidité, la mortalité et les techniques – avec pour conséquence des améliorations dans la sélection des patients.
Il a été nommé professeur de chirurgie à l’Université de Vienne en 1867, en succession de Franz Schuh ; là, il a pratiqué la chirurgie en tant que chef de la deuxième clinique chirurgicale de l’Allgemeine Krankenhaus (Hôpital général de Vienne). Bien qu’il ait jeté les bases de sa renommée à Zurich, c’est à Vienne, un théâtre plus grand et plus visible, qu’il s’est imposé comme la puissance qu’il était dans le monde de la chirurgie. Un discours qu’il a prononcé en 1875, protestant contre les afflux d’étudiants en médecine juifs, a été compté comme l’un des premiers événements dans le développement de l’antisémitisme politique viennois.
Pendant la guerre franco-prussienne, Billroth a fait un excellent travail à l’hôpital militaire de Mannheim et Weissenburg, traitant une variété de blessures horribles du champ de bataille avec des chirurgies agressives et ambitieuses ; il a incarné son expérience de la chirurgie de guerre dans ses Lettres chirurgicales de Mannheim et Weissenburg. Il a été tellement impressionné par les horreurs de la guerre qu’il est devenu par la suite un ardent défenseur de la paix. Le 3 décembre 1891, il prononça un discours sur les soins aux blessés de guerre qui fit une profonde sensation et conduisit à ce que des sommes importantes soient votées par les chambres législatives autrichiennes pour la mise en place de moyens de secours adéquats pour les blessés.
Il ne se limita pas seulement à la chirurgie et mena des recherches approfondies sur une affection qui touchait à l’époque de nombreux patients en chirurgie : la fièvre des plaies. Son traité sur la fièvre des plaies, Untersuchungen über die Vegetationsformen von Coccobacteria septica (1874 ; » Investigations sur les formes végétales de Coccobacteria septica « ) conclut que la cause est bactérienne ; Billroth n’a pas tardé à utiliser des techniques antiseptiques dans sa pratique chirurgicale, et le nombre de patients chirurgicaux atteints de fièvre des plaies a fortement diminué. La menace d’infections chirurgicales mortelles ayant diminué grâce à son travail et à celui d’autres personnes, Billroth a procédé à l’orientation de son attention vers la chirurgie et le domaine pionnier de la modification ou de l’ablation d’organes qui avaient été considérés comme inaccessibles auparavant.
Ayant adopté très tôt la « blouse blanche » (comme le montre la peinture de Seligmann vers 1890. ), Billroth est directement responsable d’un certain nombre de points de repère en chirurgie ; en 1872, il est le premier à effectuer une œsophagectomie, en retirant une section de l’œsophage et en réunissant les parties restantes. En 1873, il a réalisé la première laryngectomie, en excisant complètement un larynx cancéreux. Il a été le premier chirurgien à exciser un cancer du rectum et, en 1876, il avait pratiqué 33 opérations de ce type. En 1881, Billroth avait rendu la chirurgie intestinale presque banale. Mais sa réalisation la plus célèbre est sans conteste la première gastrectomie réussie pour un cancer de l’estomac. Le 29 janvier 1881, après de nombreuses tentatives infructueuses, Billroth a réalisé la première résection réussie pour un carcinome antral sur Therese Heller, qui a vécu près de 4 mois et est décédée de métastases hépatiques. Il a accompli cette opération en fermant le côté de la grande courbure de l’estomac et en anatomisant la petite courbure vers le duodénum, dans une opération qui est encore connue sous le nom de Billroth I à ce jour.
L’activité littéraire de Billroth était très étendue, le nombre total de livres et d’articles publiés dont il était l’auteur s’élevant à environ cent quarante. Il a collaboré avec Franz von Pitha à la rédaction d’un Textbook of General and Special Surgery (1882). Billroth y a contribué à la section sur la scrofulose et la tuberculose, les blessures et les maladies de la poitrine, les instruments et les opérations, les brûlures, les engelures, etc.
Billroth a transmis son esprit intellectuel agité à de nombreux étudiants distingués, créant ainsi l' »école Billroth » de disciples. Aucun aspect de sa profession ne semblait échapper à son examen minutieux, qu’il s’agisse de recherche, d’enseignement, d’administration ou de soins infirmiers. Non seulement il avait quelque chose de précieux à dire sur chacun d’eux, mais il veillait souvent à ce que ses idées deviennent une réalité concrète. Dans toutes les sphères qu’il cherchait à influencer, il était guidé par la croyance en l’unité de la science et de l’art, et par la confiance en sa propre capacité à provoquer le changement.
Billroth a contribué à la création de la première école de pensée moderne en chirurgie. Il avait des idées radicales sur la formation chirurgicale, préconisant un apprentissage chirurgical prolongé à la fin des études de médecine, consistant en un travail préliminaire dans les hôpitaux, suivi de la réalisation d’opérations sur des cadavres et des animaux de laboratoire. Cet apprentissage serait suivi d’une période de deux à trois ans d’assistanat dans un service de chirurgie, avec des études de la littérature chirurgicale et l’acquisition de compétences pratiques avancées. Parmi ses disciples figuraient des sommités comme Alexander von Winiwarter, Jan Mikulicz-Radecki et John B. Murphy. Le programme pionnier de résidence en chirurgie de William Halsted a été grandement influencé par les méthodes d’enseignement chirurgical de Billroth.