Après avoir traversé un spiracle, l’air pénètre dans un tronc trachéal longitudinal, pour finalement se diffuser dans un réseau complexe et ramifié de tubes trachéaux qui se subdivise en diamètres de plus en plus petits et atteint chaque partie du corps. À l’extrémité de chaque branche trachéale, une cellule spéciale fournit une interface fine et humide pour l’échange de gaz entre l’air atmosphérique et une cellule vivante. L’oxygène contenu dans le tube trachéal se dissout d’abord dans le liquide de la trachéole, puis diffuse à travers la membrane cellulaire dans le cytoplasme d’une cellule adjacente. Dans le même temps, le dioxyde de carbone, produit comme déchet de la respiration cellulaire, diffuse hors de la cellule et, finalement, hors du corps par le système trachéal.
Chaque tube trachéal se développe comme une invagination de l’ectoderme pendant le développement embryonnaire. Pour éviter son effondrement sous la pression, un fin « fil » de cuticule (les taenidia) de renforcement s’enroule en spirale à travers la paroi membraneuse. Cette conception (dont la structure est similaire à celle du tuyau de chauffage d’une automobile ou du conduit d’évacuation d’un sèche-linge) confère aux tubes trachéaux la capacité de se plier et de s’étirer sans développer de plis susceptibles de restreindre le flux d’air.
L’absence de taenidia dans certaines parties du système trachéal permet la formation de sacs d’air pliables, des structures ressemblant à des ballons qui peuvent stocker une réserve d’air. Dans les environnements terrestres secs, cette réserve d’air temporaire permet à un insecte de conserver l’eau en fermant ses spiracles pendant les périodes de stress évaporatif élevé. Les insectes aquatiques consomment l’air stocké lorsqu’ils sont sous l’eau ou l’utilisent pour réguler leur flottabilité. Au cours d’une mue, les sacs d’air se remplissent et s’agrandissent lorsque l’insecte se libère de son ancien exosquelette et en développe un nouveau. Entre les mues, les sacs aériens fournissent de la place pour une nouvelle croissance – diminuant de volume car ils sont comprimés par l’expansion des organes internes.
Les petits insectes comptent presque exclusivement sur la diffusion passive et l’activité physique pour le mouvement des gaz dans le système trachéal. Cependant, les insectes de plus grande taille peuvent avoir besoin d’une ventilation active du système trachéal (notamment lorsqu’ils sont actifs ou soumis à un stress thermique). Ils y parviennent en ouvrant certains spiracles et en en fermant d’autres, tout en utilisant les muscles abdominaux pour dilater et contracter alternativement le volume corporel. Bien que ces mouvements pulsatoires chassent l’air d’une extrémité du corps à l’autre par les troncs trachéaux longitudinaux, la diffusion reste importante pour distribuer l’oxygène aux cellules individuelles à travers le réseau de tubes trachéaux plus petits. En fait, la vitesse de diffusion des gaz est considérée comme l’un des principaux facteurs limitatifs (avec le poids de l’exosquelette) de la taille des insectes. Des périodes de l’histoire ancienne de la Terre, comme le Carbonifère, ont toutefois présenté des niveaux d’oxygène beaucoup plus élevés (jusqu’à 35 %) qui ont permis à des insectes plus grands, comme les méganeurs, ainsi que les arachnides, d’évoluer.