En 1993, alors que Santoro étudie le journalisme à la PUC-Rio, il entre à l’atelier d’acteur de Rede Globo. Santoro a ensuite joué des rôles dans de nombreuses telenovelas de Globo, comme Olho no Olho (1993), Pátria Minha (1994), Explode Coração (1995), O Amor Está no Ar (1997), Suave Veneno (1999) et Mulheres Apaixonadas (2003), ainsi que dans la mini-série Hilda Furacão (1998), dans le rôle d’un prêtre. Santoro a également été le doubleur du personnage titulaire de Stuart Little et de sa suite dans les copies doublées brésiliennes.
Son premier grand rôle dans une production cinématographique a lieu en 2001, avec Bicho de Sete Cabeças (Brainstorm) du réalisateur brésilien Laís Bodansky. À la fin du film, il a reçu une ovation du public. Il remporte également le trophée du meilleur acteur du festival. Après Bicho, sa réputation d’acteur s’est consolidée et il a obtenu le rôle principal masculin dans Abril Despedaçado (Derrière le soleil), l’un des nominés pour le meilleur film étranger aux Golden Globe Awards 2002. Dans le film Carandiru d’Hector Babenco en 2003, il joue le rôle de Lady Di, une prisonnière transsexuelle.
Le réalisateur canadien Robert Allan Ackerman a signé Santoro pour sa production télévisée Le printemps romain de Mme Stone après avoir été hypnotisé par sa performance dans Bicho de Sete Cabeças. Comme Santoro n’avait pas d’agent en Amérique du Nord, Ackerman a contacté le père de Santoro. Il passe deux mois à tourner à Rome, aux côtés d’acteurs renommés tels que Helen Mirren et Anne Bancroft. Peu après avoir terminé le tournage de Mrs. Stone, il reçoit une offre de Columbia Pictures pour un rôle dans la superproduction Charlie’s Angels : Full Throttle. Sa performance dans Charlie’s Angels donne le coup d’envoi de sa carrière à Hollywood. Après Charlie’s Angels, il joue le personnage de Karl, l’énigmatique designer en chef et l’intérêt amoureux du personnage de Laura Linney, dans la comédie romantique Love Actually, qui met également en scène Colin Firth, Lucia Moniz, Hugh Grant, Emma Thompson, Keira Knightley et Rowan Atkinson.
Il commence également à obtenir du travail dans le domaine de la publicité puisqu’il apparaît dans une campagne commerciale avec Gisele Bündchen en 2002. Il joue le rôle principal masculin dans No 5 The Film, la publicité de 3 minutes pour Chanel, réalisée par Baz Luhrmann aux côtés de Nicole Kidman en 2004.
En 2006, Santoro rejoint le casting de Lost en tant que survivant du vol Oceanic 815, Paulo. Sa première apparition a eu lieu dans l’épisode intitulé, « Further Instructions ». Son personnage a été tué dans l’épisode « Exposé ». Il fait également la voix de son personnage Paulo dans le doublage portugais pour le Brésil.
Santoro a obtenu le rôle de l’empereur perse Xerxès dans le film 300, basé sur la bande dessinée Frank Miller du même nom, en 2006. Le rôle avait de nombreuses exigences particulières, telles qu’un entraînement intensif pour la physicalité du rôle (Santoro avait perdu 24 livres pour travailler dans une mini-série brésilienne), un travail approfondi de CG pour représenter le Santoro de 6’2″ comme le Roi-Dieu de 7 pieds, un processus d’application de maquillage de quatre heures et demie et l’élimination complète des poils du corps de Santoro d’abord à la cire, puis au rasage lorsque cela s’est avéré trop douloureux. Ses sourcils sont toutefois restés intacts, recouverts de prothèses et dessinés au lieu d’être rasés. Santoro a lu les œuvres d’Hérodote, un historien de la Grèce antique, afin de se préparer à son rôle. Concernant Xerxès, il a déclaré :
Il est riche, il est arrogant, c’est un mégalomane très instable. Il veut juste conquérir le monde. Son ambition est illimitée. Il veut la gloire, il veut la victoire, il veut la gloire éternelle. Sous tout ce désir, cependant, il est finalement faible et très peu sûr de lui.
Pour son rôle dans 300, Santoro est devenu le premier acteur brésilien nommé aux MTV Movie Awards dans la catégorie du meilleur méchant. Il n’a cependant pas gagné, et le prix est allé à Jack Nicholson pour The Departed.
Il a joué le rôle du défunt footballeur Heleno de Freitas dans le film Heleno en 2012. Santoro a partagé la vedette aux côtés d’Arnold Schwarzenegger dans le film The Last Stand en 2013. Santoro a joué le rôle de Garriga dans le film dramatique de Will Smith, Focus (2015).
Santoro a joué le rôle de Jésus dans le film d’action historique Ben-Hur (2016) et a reçu les bénédictions personnelles du pape François pour ce rôle.
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