Nous avons tous entendu parler de la centrifugation, ou plus précisément des histoires d’horreur associées à une centrifugation qui tourne mal, comme dans le cas du célèbre accident de centrifugation de Cornell. La plupart des dérapages liés à la centrifugation sont dus à une mauvaise manipulation de la part de l’utilisateur. Il est donc crucial de comprendre pourquoi nous faisons ce que nous faisons pendant la centrifugation pour éviter d’endommager la machine et le personnel. Ici, j’ai listé certains des problèmes les plus courants qui peuvent être facilement négligés pendant la centrifugation et pourquoi ils sont si importants pour une bonne manipulation d’une centrifugeuse.
C’est une question d’équilibre
La centrifugation produit des forces centrifuges pour séparer efficacement les composants de l’échantillon en fonction de leur taille et de leur densité. De petits déséquilibres de poids peuvent provoquer des vibrations anormales susceptibles d’endommager le rotor. Une centrifugeuse déséquilibrée est aussi dangereuse qu’une réaction chimique instable. Il peut non seulement endommager l’instrument, mais aussi déclencher un effet domino de catastrophes allant de la défaillance de l’instrument à la rupture de l’échantillon qui pourrait libérer des contaminants potentiellement dangereux dans l’environnement (échantillons infectieux, aérosols nocifs, etc.) et aux blessures de l’utilisateur.), et des blessures de l’utilisateur, dans l’ensemble, entraînant une destruction à grande échelle et posant un risque majeur pour la sécurité.
A) La nécessité d’un équilibrage précis à haute vitesse
L’équilibrage précis est crucial lors des centrifugations à haute vitesse. Pour mieux comprendre cela, nous devons revenir à quelques notions de physique de base. Selon la deuxième loi de Newton, la force (F) est égale à la masse (M) multipliée par l’accélération (A). Ainsi, la force centrifuge générée pendant la centrifugation est directement proportionnelle à la masse et à l’accélération de l’échantillon. Lors d’un mouvement circulaire, l’accélération est liée à la vitesse de rotation et au rayon du rotor. À des vitesses élevées, même de légères variations de la masse de l’échantillon peuvent entraîner un déséquilibre de force substantiel, qui pourrait être catastrophique.
B) Équilibrage basé sur le type de rotor
Que la centrifugeuse ait un rotor à angle fixe ou un rotor à godet oscillant, deux facteurs importants à prendre en compte lors de l’équilibrage comprennent le volume de l’échantillon et la disposition symétrique des tubes. Il est important de s’assurer que les volumes d’échantillon sont égaux dans tous les tubes et que les tubes sont placés directement en face les uns des autres dans la centrifugeuse. Si le nombre de tubes est impair, égalisez-le en ajoutant un tube supplémentaire rempli d’eau au même volume que les tubes expérimentaux. Si les solutions ne sont pas de densité similaire (par exemple, l’acétone et l’eau), les tubes doivent être de masse égale plutôt que de volume égal pour être correctement équilibrés. Un facteur supplémentaire à prendre en compte dans le cas de rotors à godets oscillants est de s’assurer que toutes les fentes contiennent des godets de rotor appropriés à la machine et de même poids.
2. RCF vs RPM et pourquoi c’est important
RCF (force centrifuge relative ou force g) et RPM (révolutions par minute) sont couramment utilisés pour décrire la vitesse centrifuge. Cependant, ces unités sont complètement différentes. Le RPM désigne la vitesse de rotation, qui dépend du rayon du rotor. L’ACR désigne la force centrifuge sur les échantillons et tient compte à la fois du rayon du rotor et de la vitesse de rotation. La même ACR peut être obtenue dans des centrifugeuses avec des tailles de rotor différentes en ajustant la vitesse de rotation de manière appropriée. Cela fait de l’ACR l’unité de référence pour décrire les vitesses centrifuges car elle peut être comparée d’une centrifugeuse à l’autre, alors que la vitesse de rotation n’est constante que pour les centrifugeuses ayant le même rayon de rotor. En termes simples, RPM n’est pas égal à RCF, et les paramètres de vitesse RPM doivent être convertis en RCF pour s’assurer que la force centrifuge correcte est appliquée.
3. Temps, vitesse et centrifugation
Le choix de la vitesse de centrifugation dépend de la taille et de la fragilité des particules dans l’échantillon. Plus la taille des particules est petite, plus la vitesse de centrifugation est élevée. Par exemple, les cellules bactériennes sont pelletées à des vitesses plus élevées (2000-10 000 x g) que les cellules de mammifères (500-2000 x g). En outre, des vitesses de centrifugation plus faibles peuvent être utilisées avec des échantillons plus fragiles.
Un autre facteur critique qui influence l’efficacité de la séparation est le RCF. La FCR est proportionnelle au rayon du rotor et au carré du RPM. En raison de cette dépendance au carré de la FCR par rapport au RPM, les vitesses de centrifugation de 1000 RPM pendant 5 minutes et de 500 RPM pendant 10 minutes ne sont pas interchangeables. La première produit une ACR beaucoup plus importante que la seconde. Ainsi, il est important de tenir compte de l’ACR lorsque vous déterminez la vitesse et la durée de votre centrifugation.
4. Centrifugation à différentes températures
La centrifugation génère de la chaleur, ce qui peut augmenter la température à l’intérieur d’une centrifugeuse (parfois, de plus de 15°C). Cela peut affecter la stabilité des échantillons sensibles à la température. Dans de tels cas, les centrifugeuses réfrigérées sont généralement préférées. Cependant, il est également possible de maintenir des températures constantes dans une centrifugeuse ambiante. La température de l’échantillon pendant la centrifugation est principalement influencée par trois facteurs : le matériau du rotor, la forme du rotor et la vitesse de rotation.
A) Matériau du rotor
Pendant la centrifugation, la température peut être influencée par la conductivité thermique du matériau du rotor. Les rotors en métal, comme l’acier et l’aluminium, ont une densité et une conductivité thermique élevées. Ils transfèrent efficacement la chaleur et se refroidissent rapidement. Au contraire, les matériaux comme les polymères et les fibres de carbone sont des isolants thermiques et maintiennent une température constante.
B) Forme du rotor
La forme du rotor détermine le flux d’air à l’intérieur d’une centrifugeuse, de la même manière que les pales d’un ventilateur électrique influencent le flux d’air entrant et sortant de la machine. L’optimisation du flux d’air à l’intérieur d’une centrifugeuse par la forme du rotor est essentielle pour maintenir la température.
C) Vitesse
La vitesse de rotation est directement proportionnelle à l’augmentation de la température – à des vitesses plus élevées, plus de chaleur est générée. Il est important de comprendre la vitesse maximale de la centrifugeuse et la plage de vitesses permettant de maintenir une plage de température qui ne changera pas le résultat de l’expérience. Habituellement, ces informations seront fournies par le fabricant dans le manuel de l’équipement pour aider l’utilisateur à comprendre les limites et à les contourner.
5. Freiner ou ne pas freiner
Lors de la centrifugation, la séparation des composants de l’échantillon se poursuit pendant la phase de décélération. De nombreuses centrifugeuses offrent la possibilité de contrôler les paramètres de décélération (freins) pour l’arrêter plus rapidement, mais quand avons-nous vraiment besoin de cette option, et quel est l’effet sur les résultats de l’échantillon ?
Le freinage peut être particulièrement utile lors des centrifugations impliquant des extractions d’acides nucléiques ou des culots de cellules bactériennes, qui ne sont pas affectées par un arrêt soudain. Cependant, pour les expériences qui sont plus sensibles à une décélération brutale, comme l’isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique et les centrifugations en gradient, le freinage peut provoquer un remélange des couches séparées. Dans de tels cas, il est plus approprié de désactiver le frein afin que la décélération soit progressive et ne perturbe pas les gradients. Certaines centrifugeuses offrent une gamme de réglages de décélération. Cela peut être utile lors de la centrifugation de cellules de mammifères, qui sont sensibles aux décélérations soudaines mais qui, en même temps, nécessitent une certaine décélération pour minimiser le temps nécessaire à la centrifugeuse pour s’arrêter.
6. Où est le culot ?
L’une des applications les plus courantes de la centrifugation consiste à culotter des échantillons, tels que des cellules bactériennes, des cellules de mammifères ou des acides nucléiques. Tout en utilisant un rotor à angle fixe, l’angle du rotor détermine la position du culot. Pour vous assurer de toujours savoir où se trouve votre culot, une bonne pratique de laboratoire consiste à toujours faire tourner les tubes avec les charnières du couvercle placées dans la même orientation (par exemple, charnières du couvercle tournées vers l’extérieur). Ceci est particulièrement utile pour éviter la perte d’échantillon pendant les extractions d’ADN lorsque le culot est presque invisible après l’étape de lavage à l’éthanol. Dans le cas des rotors à godet oscillant, les culots se forment principalement au fond du tube.
Dans l’ensemble, j’espère que la lecture de cet article vous aidera à travailler plus confortablement et en toute confiance avec les centrifugeuses. Si vous avez vu ou vécu un désastre de centrifugeuse, allez-y et partagez votre histoire ainsi que tous les conseils et astuces pour assurer une centrifugation heureuse dans les commentaires ci-dessous. Que la force soit avec vous !
- Eppendorf. Sécurité de la centrifugeuse.
- Eppendorf. Conductivité thermique.
- Sigma. Température de l’échantillon pendant la centrifugation à haut débit à température ambiante en utilisant Sigma 4-5L .
- Owen Mitch Griffith. Remélange des échantillons pendant les séparations par gradient de densité avec le rotor à angle fixe Thermo Scientific Fiberlite F21-8x50y mL.
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