Matlin a fait ses débuts sur scène à l’âge de sept ans, dans le rôle de Dorothy dans un théâtre pour enfants de l’International Center on Deafness and the Arts (ICODA) du Magicien d’Oz, et a continué à se produire avec la troupe de théâtre pour enfants de l’ICODA pendant toute son enfance.
Sa découverte par Henry Winkler lors d’une de ses représentations théâtrales à l’ICODA a finalement conduit à ses débuts au cinéma dans Children of a Lesser God (1986). Le film a reçu des critiques généralement positives et la performance de Matlin dans le rôle de Sarah Norman, une femme sourde réticente à parler qui tombe amoureuse d’un homme entendant, a suscité beaucoup d’éloges : Richard Schickel du magazine TIME écrit : » Elle a un talent inhabituel pour concentrer ses émotions – et celles du public – dans sa signature. Mais il y a quelque chose de plus ici, une intelligence ironique, un esprit féroce mais pas distancié, que les films, avec leur célèbre capacité à photographier la pensée, découvrent dans très peu de performances. » Roger Ebert du Chicago Sun-Times a également été impressionné par Matlin, écrivant : « Elle tient tête à la puissance avec laquelle elle joue, portant les scènes avec une passion et une peur presque douloureuse d’être rejetée et blessée, ce qui correspond vraiment à sa rébellion », et Paul Attasanio du Washington Post a déclaré : « Le défi le plus évident du rôle est de communiquer sans parler, mais Matlin le relève de la même manière que les stars de l’ère du muet : elle agit avec ses yeux, ses gestes ». Children of a Lesser God lui vaut un Golden Globe Award de la meilleure actrice dans un film dramatique et un Academy Award de la meilleure actrice. Âgée de seulement 21 ans à l’époque, Matlin reste la plus jeune actrice à recevoir l’Oscar dans la catégorie meilleure actrice ; elle est toujours la seule sourde lauréate d’un Oscar, toutes catégories confondues.
Deux ans plus tard, elle fait une apparition dans Sesame Street avec Billy Joel qui interprète une version révisée de « Just the Way You Are » avec des paroles de Tony Geiss. Matlin a utilisé le langage des signes pendant la chanson et a fait un câlin à Oscar le râleur pendant la conclusion de la chanson. Un an après, Billy Joel l’invite à se produire dans son clip pour « We Didn’t Start the Fire ».
En 1989, Matlin incarne une veuve sourde dans le téléfilm Bridge to Silence. Dans ce rôle, elle parlait en plus d’utiliser la langue des signes. Le magazine People n’a pas aimé le film, mais a fait l’éloge du travail de Matlin, écrivant : « la belle et émotionnellement émouvante Matlin est trop bonne pour ce slop bien intentionné mais sentimental. » Elle a été nominée pour un Golden Globe pour son travail dans le rôle féminin principal de la série télévisée Reasonable Doubts (1991-1993). Matlin a été nominée pour un Emmy Award pour une apparition en tant qu’invitée dans Picket Fences (1992) et est devenue une habituée de cette série pendant sa dernière saison (1996). Elle a joué le rôle de Carrie Buck dans la série télévisée Against Her Will : The Carrie Buck Story, basé sur l’affaire Buck v. Bell 274 U.S. 200, jugée par la Cour suprême des États-Unis en 1927. Dans ce rôle, Matlin a incarné une femme entendante pour la première fois de sa carrière, ce qui lui a valu une nomination au CableACE pour la meilleure actrice. Elle a tenu un rôle secondaire important dans le drame It’s My Party (1996).
Matlin a ensuite eu des rôles récurrents dans The West Wing, et Blue’s Clues. Parmi ses autres apparitions à la télévision, citons Seinfeld (« The Lip Reader »), The Outer Limits (« The Message »), ER, The Practice, et Law & Order : Special Victims Unit. Elle a été nominée aux Primetime Emmy Awards pour ses apparitions en tant qu’invitée dans Seinfeld, Law & Order : Special Victims Unit, et The Practice.
Ted Koppel s’entretient avec Gregory Hlibok, Elizabeth Zinser et Marlee Matlin dans l’émission Nightline sur ABC le 9 mars 1988, vidéo Youtube
En 2002, Matlin a publié son premier roman, intitulé Deaf Child Crossing, qui était librement inspiré de sa propre enfance. Elle a ensuite écrit et publié une suite intitulée Nobody’s Perfect, produite sur scène au John F. Kennedy Center for Performing Arts en partenariat avec VSA Arts en octobre 2007. En 2004, elle a joué le rôle d’Amanda dans le film What the Bleep Do We Know ! Toujours en 2003, elle a accueilli le 3e festival annuel du cinéma des sourds à Chicago.
En 2006, elle a joué un parent sourd dans Desperate Housewives. Elle a tenu un rôle récurrent dans My Name Is Earl en tant que défenseur public de Joy Turner (qui a fait de nombreuses blagues sur la surdité de Matlin à ses dépens), et a joué la mère d’une des victimes dans un épisode de CSI : NY. La même année, Matlin a été choisie pour la saison 4 de The L Word dans le rôle de Jodi Lerner, une sculptrice lesbienne. Elle est apparue dans la saison 4 (2007), la saison 5 (2008) et la saison 6 (2009) comme la petite amie d’une des protagonistes de la série, Bette Porter, jouée par Jennifer Beals.
Le 4 février 2007 et le 7 février 2016, Matlin a interprété le « Star Spangled Banner » en langue des signes américaine lors du Super Bowl XLI à Miami, en Floride, et lors du Super Bowl 50 à Santa Clara, en Californie, respectivement. En janvier 2008, elle est apparue dans la série Nip/Tuck en tant que cadre de télévision.
En 2008, Matlin a participé en tant que concurrente à la sixième saison de l’émission Dancing with the Stars sur ABC. Son partenaire de danse était le nouveau venu Fabian Sanchez. Matlin et Sanchez ont été le sixième couple éliminé de la compétition.
Le 6 mai 2009, Matlin a reçu une étoile sur le Hollywood Walk of Fame.
Le 8 novembre 2009, Matlin est apparue dans l’émission Seth & Alex’s Almost Live Comedy Show, animée par Seth MacFarlane et Alex Borstein. Après que Borstein ait imité Matlin en train d’appeler MovieFone et de chanter « Poker Face », Matlin elle-même est apparue et s’est lancée dans une tirade comique contre Borstein sur le fait qu’on se soit moqué d’elle, et sur le fait qu’elle n’a pas été invitée à fournir sa propre voix pour Family Guy. Matlin a ensuite prêté sa voix à Stella, la collègue de Peter Griffin, dans l’épisode » The Blind Side » de la saison 10 ; Stella est ensuite devenue un personnage récurrent.
En 2010, Matlin a produit un pilote pour une émission de téléréalité qu’elle a intitulée My Deaf Family, qu’elle a présenté à divers dirigeants de réseaux nationaux. Bien qu’ils aient exprimé leur intérêt, aucun réseau n’a acheté les droits de l’émission. Le 29 mars 2010, Matlin a téléchargé le pilote sur YouTube et a lancé une campagne de marketing viral.
Le 26 juillet 2010, Matlin a signé un discours lors d’un événement commémorant le 20e anniversaire de l’Americans with Disabilities Act.
L’année suivante, Matlin a été finaliste de l’émission The Celebrity Apprentice de NBC, concourant pour gagner de l’argent pour son organisme de bienfaisance, la Starkey Hearing Foundation, et a terminé à la deuxième place. Cependant, lors d’un épisode de The Celebrity Apprentice, « The Art of the Deal », qui a été diffusé le 3 avril 2011, elle a collecté plus de fonds que ce qui avait jamais été collecté pour une œuvre de bienfaisance en un seul événement dans une émission de télévision auparavant, soit 986 000 dollars. Donald Trump, qui animait alors The Celebrity Apprentice, a ensuite donné 14 000 dollars supplémentaires pour que la contribution atteigne même un million.
En 2013, Matlin a joué son propre rôle dans No Ordinary Hero : The SuperDeafy Movie. En janvier 2015, Matlin a également joué le rôle d’ambassadrice des célébrités de l’ACLU pour les droits des personnes handicapées.
En tant qu' »ambassadrice des célébrités » de l’ACLU, pour tenter de combler le fossé entre les forces de l’ordre et la communauté des sourds, Matlin a discuté des barrières de communication lorsque des personnes sourdes sont arrêtées par la police.
Matlin a joué le personnage récurrent de Melody Bledsoe dans Switched at Birth. En septembre 2015, elle a fait ses débuts à Broadway dans la production de reprise de la comédie musicale Spring Awakening.
À partir de 2017, Matlin a joué le rôle récurrent de Harriet dans la série télévisée de Syfy, The Magicians.
Le 31 juillet 2017, il a été annoncé par Deadline que Matlin a rejoint en tant que série régulière la troisième saison du thriller Quantico d’ABC. Elle jouait le rôle de l’ex-agent du FBI Jocelyn Turner.
En 2019, Marlee Matlin a été mentionnée dans un article de Hearing Like Me comme quelqu’un qui pourrait apporter plus de #DeafTalent à « Life and Deaf », une nouvelle émission comique qui vise à explorer la vie d’un enfant avec des parents sourds. Cette nouvelle série, dont l’action se déroule dans les années 1970, mettra en vedette l’actrice primée et activiste sourde Marlee Matlin. Cette émission devait être produite de manière exécutive par Marlee Matlin, selon Deadline.