Les bactéries prennent forme : Déterminants génétiques de la morphologie d’E. coli

OBSERVATION

Les formes des cellules bactériennes représentent des milliards d’années de raffinement évolutif. Leur petite taille se traduit par des rapports surface/volume élevés, qui sont idéaux pour le transport des nutriments, une respiration efficace et le maintien de l’intégrité structurelle. On sait que la forme globale des cellules est régie par une multitude de processus cellulaires et d’indices environnementaux (1-3). Cependant, il devient rapidement difficile de déterminer avec précision l’impact des variations de la forme sur la fonction cellulaire. Les données à l’échelle du génome décrivant les contributions génétiques à la morphologie bactérienne constituent un pas vers la réponse à cette question. En outre, les réseaux d’interaction qui en résultent représentent de multiples réseaux biologiques liés découlant de différents phénotypes de forme. Dans ce document, nous décrivons un instantané génomique de la morphologie d’Escherichia coli K-12 à la phase mi-exponentielle en utilisant la collection de délétions Keio (4). Nous caractérisons en outre les interactions génétiques entre les délétions ayant un impact sur la forme et le génome d’E. coli en utilisant la conjugaison à haut débit (5, 6).

La plateforme d’imagerie à haut contenu que nous avons développée est hautement adaptée à la tâche compliquée de l’imagerie bactérienne. Les temps d’imagerie pour les plaques de micropuits à haute densité (384 ou 1 536 puits) peuvent largement dépasser le temps de doublement d’environ 20 minutes pour E. coli, ce qui présente des défis temporels pour l’imagerie des bibliothèques génomiques dans une phase commune de croissance. De plus, la motilité des cellules bactériennes vivantes présente des difficultés supplémentaires pour limiter la mobilité des cellules pendant l’imagerie microscopique. Nous avons relevé ces défis en utilisant un fixateur de glutaraldéhyde, une première étape courante dans les préparations de microscopie électronique et connue pour préserver la forme des cellules avec des impacts négligeables à la résolution de la microscopie optique (7). Les cellules ont ensuite été colorées négativement dans des plaques d’imagerie à fond de verre (0,17 mm d’épaisseur) à l’aide de nigrosine et fixées doucement à la chaleur avec contrôle de l’humidité, amenant toutes les cellules à un plan focal commun. Il n’était donc pas nécessaire d’utiliser le contraste de phase, qui n’était pas utilisable car le cône de lumière de l’anneau de phase était bloqué par les bords des puits dans les microplaques de 384 puits et de densité supérieure. L’utilisation d’un champ lumineux permet de faire passer plus de lumière à travers l’échantillon, ce qui permet une exposition plus rapide et une meilleure précision focale. Les plaques préparées de cette manière peuvent être réimagées indéfiniment, et la qualité de l’image ne se dégrade pas avec le temps, ce qui facilite l’imagerie à haut contenu d’échantillons qui ont été fixés dans une phase de croissance spécifique. Les images résultantes présentent un contraste intense entre les cellules et le fond, ce qui est hautement souhaitable pour l’imagerie quantitative (Fig. 1 ; détails complets dans le texte S1 et la Fig. S1 du matériel supplémentaire). Dix caractéristiques morphologiques ont été quantifiées par knockout : surface, périmètre, axe d’ellipse minimum, longueur de Feret minimum, axe d’ellipse majeur, longueur de Feret majeur, circularité, rondeur, rapport d’aspect et solidité. Nous avons ensuite utilisé l’analyse en composantes principales (ACP) comme analyse multiparamétrique et moyen de réduction de la dimensionnalité (Fig. 1 ; Fig. S1). Nous avons ainsi obtenu un moyen totalement impartial de tri phénotypique après acquisition. Les traitements de forme anormale ont été révélés en ajustant un ellipsoïde autour du groupe de données représentant la morphologie de type sauvage dans l’espace des composantes principales et en sélectionnant ceux qui tombent en dehors de cette zone de coupure. Les limites x, y et z de l’ellipsoïde dans chaque dimension correspondent à une coupure de 3 écarts-types dans les trois premières composantes principales.

De cette manière, nous avons identifié quelque 111 mutants de délétion avec des défauts de forme (voir le tableau S1 et l’ensemble de données S1 dans le matériel supplémentaire). Notre approche a été validée par la confirmation de plusieurs mutants de forme connus, y compris le mutant de délétion tatA, dont il a été démontré précédemment qu’il était long et enchaîné en raison d’une mauvaise localisation des amidases dans le périplasme (8). Des mutations dans holD, codant pour la sous-unité ψ de l’ADN polymérase III, sont connues pour provoquer des morphologies filamenteuses chez E. coli (9). En effet, la réplication de l’ADN a une relation synchrone avec les processus de division cellulaire (10, 11), les perturbations de l’ADN gyrase entraînant des cellules allongées avec des chromosomes uniques et sans septa (12). De manière intéressante, la pyridoxine 5′-phosphate oxydase, codée par pdxH, génère du pyridoxal 5′-phosphate (PLP) et a provoqué une évolution vers des cellules longues et occasionnellement enchaînées. Le PLP est un cofacteur clé dans la fourniture de d-alanine et de d-glutamate pour la synthèse du peptidoglycane de la paroi cellulaire (13), et les mutants pdxH sont connus pour avoir un phénotype filamenteux (14). De même, EnvC est un activateur des enzymes de remodelage de la paroi cellulaire et est connu pour provoquer une croissance filamenteuse (15), et RodZ est impliqué dans la formation des parois latérales et est connu pour provoquer une morphologie sphérique (16). Ces phénotypes ont tous été confirmés dans notre criblage. Étonnamment, 52 gènes de notre liste codent pour des protéines non caractérisées chez E. coli, dont plusieurs sont des protéines putatives de la membrane externe ou cytoplasmique (Tableau S1). Ainsi, la plateforme de criblage à haut contenu décrite a identifié des gènes non essentiels impliqués dans le maintien de la forme. Pour caractériser et sonder davantage les processus biologiques qui interagissent avec ces mutations, nous avons choisi de préparer un tableau d’interactions génétiques en nous concentrant sur ces gènes de forme.

Au total, 60 délétions correspondant aux plus forts défauts de forme ont été choisies comme gènes de requête dans un réseau génétique synthétique, dont 7 ne se sont pas bien conjugués selon la méthodologie de Côté et al. (17). Ainsi, 53 gènes de forme d’intérêt du tableau S1 ont été systématiquement croisés (5, 6) avec la collection Keio, générant 1,7 × 107 mutants à double délétion (voir ensemble de données S2 dans le matériel supplémentaire) et un réseau synthétique d’interactions létales (voir figure S3 dans le matériel supplémentaire). Nous avons remarqué que les mutants présentant des variations de forme plus extrêmes (par exemple les mutants pdxH, rodZ, envC et gpmM) ne s’accouplaient pas correctement dans des conditions conventionnelles et nécessitaient un accouplement à température ambiante pendant une période prolongée. Lorsque les gènes sous-jacents aux interactions létales synthétiques ont été enrichis à l’aide des termes de Gene Ontology (GO) pour les processus biologiques, les processus de transport et d’oxydation-réduction étaient surreprésentés (figure 2 ; figure S3). Ceci était basé sur un histogramme de fréquence d’occurrence pour chaque terme GO, avec des ontologies accessibles à l’aide du logiciel pathway-tools EcoCyc (18) (19). Il est intéressant de noter que le canal de la membrane externe TolC est présent avec une fréquence élevée, ce qui implique une relation entre l’efficacité du système d’efflux des médicaments (Acr, Mdt, Ent, Emr et Mac) et la forme de la cellule. Le symporteur prédit YdjN, qui apparaît le plus fréquemment, est également impliqué dans le transport de la l-cystéine et la réponse au stress oxydatif (20), des processus biologiques enrichis par coïncidence dans la Fig. 2. En effet, les gènes impliqués dans les processus redox étaient souvent liés à la respiration, comme dans les cas de ytfG, napG, cydB, nrdD, et nrdG. Ceci est particulièrement curieux étant donné que la forme/courbure de la membrane joue un rôle dans la fonction des protéines associées à la membrane (21, 22), notamment en raison des relations potentielles entre l’efficacité des médicaments et la respiration cellulaire (23, 24). Cependant, la compréhension du lien entre la forme (ou la surface) des cellules et la respiration est limitée. Nous avons été témoins d’une prépondérance remarquable d’interactions entre les gènes de forme et ceux impliqués dans les fonctions respiratoires. Par exemple, dans le travail de Côté et al. (17), 82 gènes de stress nutritif ont été croisés avec la collection Keio et ont donné lieu à moins de 200 interactions létales synthétiques avec des gènes impliqués dans les processus d’oxydoréduction, alors qu’en revanche, environ 800 interactions de ce type ont été observées pour 53 gènes perturbateurs de forme (Fig. 2).

La recherche dans la collection Keio de délétions de gènes entraînant des défauts de forme a donné lieu, de manière inattendue, à une multitude de gènes non caractérisés. La mise en relation de ces gènes avec des rôles dans la forme cellulaire peut aider à la classification fonctionnelle en aval, en particulier lors du profilage simultané de leurs interactions génétiques. Dans l’ensemble, les gènes impliqués dans le maintien de la forme semblent être intrinsèquement liés à des processus biologiques tels que le transport et l’oxydation et la réduction, mais des travaux supplémentaires sont nécessaires pour clarifier la nature des interactions observées. Il est particulièrement intéressant de savoir si des perturbations physiques telles que des variations de la géométrie de l’emballage ou de la courbure (21) accompagnent les défauts de forme. Néanmoins, les recherches présentées ici élargissent notre compréhension de la biologie complexe qui définit la forme des bactéries. En outre, la plate-forme de microscopie à haut contenu décrite ici est hautement modifiable pour toute bibliothèque génomique ou chimique bactérienne.