Source de l’échantillon humain
Un total de 133 embryons humains au stade 2PN utilisés dans l’étude actuelle ont été obtenus à partir de la Biobanque RENEW de l’Université de Stanford, avec un consentement éclairé écrit indiquant qu’ils ont été donnés pour la recherche non-stérile. Tous les embryons ont été congelés au stade zygotique ou 2PN, et il est très probable que ces embryons représentent la population typique de la FIV, puisqu’ils n’ont pas été sélectionnés avant la cryoconservation. La dépersonnalisation a été effectuée conformément au protocole « The RENEW Biobank », qui a été approuvé par le conseil d’examen institutionnel de l’université de Stanford. Aucune information de santé protégée n’a été associée aux embryons. Sur les 133 embryons décongelés, 91 sont apparus vivants après la décongélation, et les autres ont été exclus car ils n’étaient visiblement pas viables (avant toute aspiration par micropipette). Deux autres embryons ont été exclus de nos données parce qu’ils étaient structurellement endommagés pendant l’aspiration de la micropipette et à cause de la rupture de la ZP, ce qui nous laisse 89 embryons humains au total dans notre ensemble de données. Ces 89 embryons humains ont été décongelés et mesurés en plus petits groupes au cours de six expériences distinctes.
Culture d’embryons humains
Les embryons humains ont été décongelés à l’aide d’un kit de décongélation Quinn’s Advantage (CooperSurgical) comme décrit précédemment26,27. En bref, les cryovials ou paillettes ont été retirés du réservoir d’azote liquide et exposés à l’air avant d’être placés dans un bain d’eau à 37°C. Une fois décongelés, les embryons ont été incubés dans un milieu de décongélation au saccharose 0,5 et 0,2 M à 37 °C pendant 10 minutes chacun. Les embryons ont ensuite été lavés dans une solution de diluant de décongélation à 37 °C et cultivés pendant 3-4 h dans le milieu de clivage de l’avantage de Quinn (CooperSurgical) complété par un substitut de protéine de sérum à 10% (CooperSurgical). Dans certaines expériences, les embryons ont été surveillés pour leur développement à l’aide du système Eeva (Auxogyn).
Collection d’embryons et d’ovocytes de souris et FIV
Les souris F1 de souche hybride (C57B6xDBA2) (femelles âgées de 4 à 6 semaines) ont été achetées au Jackson Laboratory et maintenues dans l’animalerie du bâtiment de recherche sur les cellules souches Lorry Lokey. Toutes les expériences ont été réalisées conformément au protocole n°16146 de l’Institutional Animal Care and Use Committee, qui a été approuvé par le Administrative Panel on Laboratory Animal Care de l’université de Stanford. En bref, les souris femelles ont été superovulées par injection intrapéritonéale de 10 UI de gonadotrophine sérique de jument gravide (PMSG, Sigma) et de 10 UI de gonadotrophine chorionique humaine (hCG, Sigma). Après l’accouplement d’une femelle avec un mâle de 8-10 semaines de la même souche, les complexes cumulus-ovocytes ont été collectés à partir des oviductes dans le milieu M2 (Millipore) et les cellules cumulus ont été éliminées dans de l’Hyaluronidase (Sigma) et lavées dans le milieu M2. Après les mesures mécaniques, les embryons ont été cultivés dans le milieu de clivage de l’avantage de Quinn (CooperSurgical) avec un substitut de protéine de sérum à 10% (CooperSurgical). Pour mesurer l’effet de la maturation des ovocytes sur la mécanique, les ovocytes ont été collectés à différents stades de maturation. Les ovocytes GV ont été recueillis 48 h après l’injection de PMSG. Environ 48 h après l’injection de PMSG, la hCG a été injectée. Les ovocytes MI ont été recueillis 5 à 6 h après l’injection de hCG, et les ovocytes MII ont été recueillis 18 à 20 h après l’injection de hCG.
Les embryons ont été exclus de nos données s’ils présentaient une très mauvaise morphologie, s’ils provenaient de souris ayant produit moins de 10 embryons ou s’ils faisaient partie d’un groupe où moins de 40 % des embryons présentaient une formation de pronucléus après la FIV. Si les souris produisaient trop peu d’embryons ou si les taux de fécondation étaient trop faibles, nous avons estimé que certaines parties du protocole expérimental (injection d’hormones, milieu, etc.) avaient dû affecter négativement les embryons et qu’ils n’étaient donc pas représentatifs d’embryons de souris normaux. Pour trier les embryons en groupes de contrôle et de mesure, ils ont été séparés au hasard tout en étant observés sous un grossissement suffisamment faible pour que la morphologie soit difficile à distinguer. Seuls quelques embryons ont été conservés comme témoins négatifs dans chaque expérience, pour un total de 35 sur l’ensemble des expériences (figure supplémentaire 5). La taille des échantillons pour les expériences sur les animaux a été déterminée en partie par la quantité de données nécessaires pour atteindre une signification statistique, et en partie par la taille des échantillons observés dans des publications avec des recherches similaires. Les données sur la mécanique et la formation de blastocystes pour les 282 embryons de souris que nous avons mesurés (figure supplémentaire 4 et figure supplémentaire 5) ont été recueillies au cours de 15 expériences distinctes.
Micro-injection d’ovocytes de souris et FIV
Une souche de souris CBA du Jackson Laboratory a été utilisée dans cette expérience. Après une superovulation induite de souris femelles âgées de 4 à 6 semaines, les ovocytes arrêtés en métaphase II ont été collectés et les cellules cumulus retirées. Les ovocytes ont ensuite été micro-injectés avec ∼10 pl d’anticorps monoclonal 18A10 (abCam) à une concentration de 1 mg ml-1. Certains ovocytes ont été conservés comme témoins négatifs et ont subi soit une injection sham avec de l’eau, soit aucune injection. Les ovocytes ont ensuite été mis en culture pendant une heure avant la FIV conventionnelle. Des spermatozoïdes ont été prélevés sur des mâles CBA âgés de 8 à 10 semaines (Jackson Laboratory) et ont été laissés à capaciter dans un milieu HTF (CooperSurgical) pendant 45 minutes avant l’insémination. Une quantité appropriée de la suspension de sperme a été ajoutée à la goutte de milieu où les ovocytes ont été cultivés. Aucun échantillon n’a été exclu de cette expérience, et les ovocytes ont été triés en groupes de contrôle par rapport aux groupes mesurés sans tenir compte de la morphologie et dans un ordre aléatoire.
Mesure des propriétés mécaniques des embryons
Un système automatisé d’aspiration par micropipette a été utilisé pour mesurer les embryons, et un microscope optique construit sur mesure a été utilisé pour enregistrer la vidéo de l’aspiration. Le microscope optique a été construit avec des pièces provenant de Thorlabs, et il utilise un objectif Olympus × 20, à ouverture numérique de 0,4 et un éclairage par diode électroluminescente blanche. Pour effectuer une mesure, chaque embryon est placé dans sa propre goutte de milieu et la micropipette est descendue dans la goutte. L’embryon est manipulé avec la pipette de façon à ce que le corps polaire soit opposé à l’ouverture de la pipette. Le fait de ne pas contrôler la position de mesure pourrait fausser nos résultats, car il existe un espace entre l’oolemma et le ZP près du corps polaire, alors que cet espace périvitellin est beaucoup plus petit autour du reste de l’embryon. Des études ont également montré que la tension corticale des ovocytes est polarisée par rapport au fuseau méiotique66 ; nous avons donc pris soin de mesurer l’extrémité de l’embryon opposée au corps polaire, qui est généralement proche du fuseau.
Les micropipettes destinées à mesurer les embryons de souris avaient un diamètre intérieur de 40-μm (Origio MBB-FP-L-15) ; celles destinées aux embryons humains avaient un diamètre intérieur de 70-μ et ont été fabriquées sur mesure par Origio. Une pression de maintien de -0,03 p.s.i. est appliquée pour maintenir l’embryon et sceller l’ouverture de la pipette. Ensuite, une pression progressive de -0,345 p.s.i. est appliquée à l’embryon. La pression souhaitée est appliquée à l’aide d’un système de contrôle PID en boucle fermée. Un actionneur linéaire (Firgelli L12) déplace le bouchon d’une seringue de 1 ml, et un capteur (Honeywell SSCSNBN010NDAA5) mesure la pression. Ces éléments sont connectés à un ordinateur via un microcontrôleur Arduino Uno qui peut relayer les lectures du capteur et donner des ordres à l’actionneur en temps réel. Une vidéo de l’aspiration est enregistrée à 75 f.p.s. à l’aide d’une caméra CMOS (Thorlabs DCC1545M). Tout le matériel est contrôlé à l’aide du logiciel Labview (National Instruments). Un programme Matlab automatisé et personnalisé (Mathworks) a été utilisé pour extraire la profondeur d’aspiration de l’embryon et l’adapter à un modèle mécanique. La détection des bords et le seuillage de Canny ont été utilisés pour identifier le coin et l’ouverture de la pipette. La correspondance des modèles basée sur la corrélation croisée a été utilisée pour suivre automatiquement le bord de l’embryon dans le temps afin d’éliminer le biais des mesures manuelles. Pendant la mesure des paramètres mécaniques de l’embryon, l’investigateur était aveugle quant à savoir s’ils avaient survécu au stade de blastocyste ou non, ou à quel groupe ils appartenaient (dans le cas des expériences de micro-injection).
Modèle mécanique des embryons unicellulaires
Un modèle solide élastique linéaire modifié (modèle de Zener modifié) a été utilisé pour représenter l’embryon lorsqu’il était aspiré dans la micropipette. En supposant une entrée par étape pour la force appliquée à l’embryon, l’équation pour la profondeur d’aspiration en fonction du temps est :
Où
Le modèle de Zener modifié a été choisi par rapport à d’autres modèles viscoélastiques couramment utilisés tels que les modèles de Maxwell, Kelvin-Voigt et Zener (solide linéaire standard) sur la base d’une inspection visuelle de la dynamique de la réponse. Nous avons observé dans nos expériences que la réponse d’un embryon à une entrée de pression d’étape était une élongation instantanée suivie d’une composante de décroissance exponentielle (inversée de sorte que la déformation augmente au fil du temps), enfin suivie d’une déformation à un taux constant comme le montre la figure 2c.
Un corps de Maxwell se compose d’un ressort et d’un dashpot en série ; par conséquent, sa réponse à une pression d’étape est une élongation instantanée suivie d’une déformation linéaire constante. Comme nos données affichaient une composante exponentielle claire, ce modèle a été jugé insuffisant pour décrire notre système. Un corps de Kelvin-Voigt se compose d’un ressort et d’un dashpot en parallèle ; par conséquent, sa réponse à une pression graduelle est une exponentielle décroissante où la profondeur d’aspiration s’établit sur une profondeur maximale finale. Ce modèle ne rend pas compte de l’élongation instantanée subie par l’embryon ni du taux de déformation linéaire après que la composante exponentielle se soit stabilisée. Le modèle de Zener ajoute un ressort supplémentaire en parallèle au corps de Maxwell et sa réponse à la pression est similaire à celle d’un corps de Kelvin-Voigt, mais avec un allongement instantané lorsque la pression est appliquée pour la première fois. Malgré tout, ce modèle a nécessité l’ajout d’un dashpot supplémentaire en série avec les trois autres composants pour capturer avec précision la déformation linéaire subie par l’embryon après que la composante exponentielle se soit installée.
Une comparaison de l’erreur d’ajustement pour cinq modèles différents est présentée dans la figure supplémentaire 10. Notre modèle (qui comporte 4 paramètres) semble approprié car son erreur est presque aussi faible que l’erreur du modèle à cinq paramètres, avec ou sans le paramètre supplémentaire inutile. Nous pensons donc que notre modèle décrit précisément les données sans surajustement.
Évaluation de la viabilité de l’embryon et des paramètres du cycle cellulaire
La formation de blastocystes a été utilisée comme un proxy pour la viabilité lors de la construction d’un classificateur pour distinguer les embryons viables et non viables en fonction de la mécanique. Ce classificateur a été validé chez la souris comme le montrent les expériences de naissance vivante de la figure 2. Après la mesure des paramètres mécaniques de l’embryon au jour 1, les embryons ont été cultivés pendant 5 à 6 jours dans le système Auxogyn Eeva, avec des images capturées toutes les 5 minutes. Les paramètres du cycle cellulaire27 ont été extraits des vidéos résultantes, et les embryons formant des blastocystes au jour 5 (souris) ou au jour 6 (humain) ont été catégorisés comme viables.
Prédiction de la viabilité des embryons
La survie des blastocystes a été utilisée comme information de vérité fondamentale pour former un classificateur afin de prédire la viabilité des embryons sur la base des mesures mécaniques du jour 1. Un classificateur SVM binaire avec un noyau RBF a été entraîné sur les paramètres mécaniques de l’embryon. Les valeurs optimales pour la contrainte de boîte (c) et le sigma RBF (σ) ont été choisies en utilisant une validation croisée à 10 reprises. Une fois que les paramètres SVM optimaux ont été déterminés, 100 simulations Monte Carlo de validation croisée 10 fois ont été effectuées pour calculer l’aire moyenne sous la courbe ROC et la courbe PR.
Parce qu’un total de quatre paramètres mécaniques ont été mesurés pour chaque embryon, une sélection avancée des caractéristiques a été effectuée pour déterminer le nombre optimal de paramètres à inclure dans notre classificateur de viabilité. Les résultats de ce processus sont présentés dans la figure supplémentaire 2C, démontrant qu’il y a une grande amélioration lorsqu’on utilise deux paramètres au lieu d’un, et une légère amélioration lorsqu’on ajoute un troisième paramètre. L’utilisation des quatre paramètres réduit l’efficacité de notre classificateur, car le quatrième paramètre n’est pas utile pour séparer les embryons par viabilité, mais ajoute une dimension supplémentaire aux données.
Pour effectuer la sélection de caractéristiques vers l’avant, chaque paramètre a d’abord été utilisé seul pour séparer les embryons et un classificateur optimal a été trouvé. Comme décrit ci-dessus, une validation croisée 10 fois a été effectuée pour estimer l’aire sous la courbe ROC pour ce paramètre. Une fois que le paramètre ayant la valeur prédictive la plus élevée a été choisi, un nouveau classificateur a été formé et optimisé en utilisant chacun des paramètres restants. Le paramètre qui a provoqué la plus grande amélioration de la valeur prédictive a été ajouté au classificateur, et le processus a été répété jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de paramètres.
Pour les expériences sur la libération des granules corticaux, les figures ont été présentées en utilisant uniquement le paramètre le plus prédictif de la viabilité (rigidité, k1) pour des raisons de simplicité. Le classificateur à trois paramètres précédemment formé a été utilisé pour trier les embryons par viabilité, mais nous avons déterminé que les figures étaient plus claires en utilisant uniquement la rigidité.
Expériences de naissances vivantes chez la souris
Les souris femelles CD1 ont été achetées au Jackson Laboratory et accouplées avec des mâles vasectomisés pour servir de receveuses pseudo-enceintes. Les souris ont été maintenues dans les mêmes conditions que celles utilisées pour la collecte des embryons. Les paramètres mécaniques des embryons collectés chez les souris (C57B6xDBA2) F1 ont été mesurés et les embryons ont été triés en groupes viables ou non viables en fonction de ces paramètres. Dans chaque expérience, un nombre égal d’embryons de souris au stade unicellulaire (entre 10 et 15) a été transféré dans l’oviducte d’une receveuse d’embryons récemment branchés. Cette expérience a été répétée quatre fois (Tableau supplémentaire 1) avec 10 à 15 embryons transférés à chaque souris dans chaque expérience. Le technicien qui transférait les embryons ne savait pas quels embryons se trouvaient dans quel groupe. Le même nombre d’embryons au même stade de développement a été choisi au hasard et transféré à des souris pseudo-enceintes comme contrôle. Les petits étaient attendus le jour 20 après la chirurgie. Un test χ2 a été réalisé pour vérifier si la différence du nombre de petits nés dans chaque groupe (viable, non viable ou témoin) était statistiquement significative.
Préparation des échantillons d’ARN-seq
Deux expériences distinctes ont été réalisées avec un total de 32 embryons humains 2PN pour obtenir des échantillons pour l’ARN-seq. Les embryons ont été autorisés à récupérer pendant 3-4 h dans un milieu de culture après décongélation et les paramètres mécaniques ont été mesurés. Chaque embryon a été classé comme viable ou non viable en fonction de ses paramètres mécaniques. L’ADNc de chaque embryon a été synthétisé à partir de l’ARN total à l’aide du kit SMARTer Ultra Low RNA (Clontech) conformément au protocole du fournisseur. Après le cisaillement Covaris de l’ADNc complet, les bibliothèques finales ont été générées à l’aide du NEBNext DNA Sample Prep Master Mix Set (New England Biolabs) et soumises à un contrôle de qualité avec un bioanalyseur Agilent 2100. Les échantillons résultants ont ensuite été soumis à un séquençage ARN unicellulaire sur une plateforme Illumina HiSeq 2000 en utilisant la stratégie de séquençage paired-end 100-bp.
Sur les 25 embryons choisis pour le séquençage, trois embryons ont été exclus en raison de difficultés techniques (aucun ARN récupéré). Nous avons soumis un total de 22 embryons pour le séquençage, qui ont été classés comme viables ou non viables sur la base de paramètres mécaniques.
Traitement des données ARN-seq
Le séquençage a retourné ∼1 milliard de lectures paired-end de longueur 101 appartenant à 22 embryons au total. Les données brutes de séquence au format fastq ont été passées au contrôle de qualité pour éliminer les appels de base de faible qualité et les séquences adaptatrices (trimmer et clipper FastX). Les séquences filtrées ont ensuite été alignées sur le génome humain de référence (hg18) avec l’outil STAR aligner67 sur un ordinateur. Les fichiers .bam résultants ont été filtrés pour la qualité de l’alignement, triés et les doublons PCR supprimés (SAMtools sort et rmdup). Les décomptes par gène ont ensuite été calculés à l’aide de l’outil HTSeq-count68 et en comparant les lectures alignées au transcriptome humain de référence.
Pour tenir compte des éventuels effets de lot découlant des variations biologiques entre les patients, des différents protocoles de congélation, des milieux de culture ou d’autres facteurs, nous avons dû déterminer quels embryons provenaient de quels patients. Nous avons analysé les variants de séquence dans les transcriptomes de chaque embryon et effectué un regroupement hiérarchique sur les variants pour lesquels nous avions une bonne couverture de séquençage (figure supplémentaire 11). Nous avons déterminé que sur les 22 embryons séquencés, 17 avaient des embryons » frères et sœurs « , tandis que 5 étaient les seuls embryons de leurs patients respectifs. Nous avons exclu ces cinq embryons, puis nous avons utilisé la fonction ComBat du paquet sva69,70 de R pour éliminer les effets de lot des données RNA-seq des 17 embryons restants. Bien que l’exclusion des cinq embryons sans frères et sœurs ait pu fausser nos résultats, il aurait été impossible d’estimer la variation biologique au sein de ces patients en utilisant un seul échantillon et nous avons donc dû les exclure. Après l’élimination de ces effets de lot, nos données ont reflété des différences dans les transcrits hérités par la mère entre les embryons viables et non viables, et ce, pour toutes les patientes. L’analyse de l’expression différentielle a été menée sur les données ajustées à l’aide du package R edgeR28. Les gènes avec des valeurs q (valeurs P ajustées par la méthode de Benjamini-Hochberg) inférieures à 0,01 ont été classés comme statistiquement significatifs.
Analyse de l’ontologie et du réseau des gènes
La liste des gènes DE avec des valeurs q<0,01 a été passée dans l’outil DAVID (NCBI), et le clustering a été effectué avec des termes ontologiques liés aux BP et aux fonctions moléculaires (MF). Les clusters comportant au moins un terme avec une valeur P ajustée<0,05 ont été jugés statistiquement significatifs et inclus dans le tableau 1. Les termes de chaque groupe ont été combinés en une seule phrase descriptive et inclus dans le tableau 1. Une analyse plus approfondie de l’ontologie des gènes a été menée avec les paquets goseq et GO.db dans R. Toutes les catégories d’ontologie des gènes avec au moins 10 gènes ont été classées dans l’ordre du pourcentage de gènes DE dans cette catégorie, et comparées à la proportion de gènes DE dans toutes les catégories.
L’IPA a été utilisé pour analyser la liste des gènes DE ainsi que le changement log-fold entre les embryons viables et non viables. Une analyse de base a été menée pour trouver les processus cellulaires qui ont été prédits comme étant significativement augmentés ou diminués sur la base des changements d’expression des gènes, ainsi que les réseaux de gènes qui ont été régulés en tant que groupe.
La coloration des granules corticaux
Les paramètres mécaniques des embryons de souris B6 et des embryons issus de FIV (de souris CBA) ont été mesurés au stade zygote dans deux expériences distinctes. Les embryons ont été classés comme viables ou non viables en fonction de leurs paramètres mécaniques, puis la ZP a été éliminée en exposant brièvement les embryons à la solution de Tyrode (Sigma), suivie de trois lavages dans du PBS (Invitrogen). Les embryons dénudés ont ensuite été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 20 minutes à température ambiante et colorés avec un anticorps anti-Lectine marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine (Sigma) et du 4,6-diamidino-2-phénylindole. Un microscope confocal à balayage laser Zeiss LSM510 a été utilisé pour la visualisation et la capture d’images.
Traitement des images confocales
Les piles d’images brutes ont été converties au format TIFF et des scripts Matlab personnalisés ont été écrits pour extraire les paramètres des images. Un ajustement du contraste a été effectué sur toutes les images de chaque pile pour tenir compte de la perte de signal à des profondeurs d’imagerie plus importantes, et une image de projection a été calculée pour chaque pile. Le cytoplasme de chaque cellule a été isolé en effectuant un seuillage automatique à l’aide de la méthode d’Otsu, une détection des bords de Canny et une transformation de Hough circulaire pour détecter l’emplacement et la taille de chaque cellule. Un profil d’intensité a été calculé le long d’un chemin autour de la circonférence de chaque cellule, à 95% du rayon de la cellule, et avec une largeur de 10% du rayon de la cellule. Les paramètres représentés sur l’image 4 sont (a) la moyenne et (b) l’écart-type de ce profil d’intensité. L’investigateur était aveugle aux paramètres mécaniques et au groupe de chaque embryon (dans le cas des expériences de micro-injection) pendant la mesure des paramètres des granules corticaux.
Tests statistiques
Un test χ2 a été utilisé pour tester si la proportion d’embryons aboutissant à une naissance vivante (section 2.2) était significativement différente entre les trois groupes expérimentaux (prédit viable basé sur la mécanique, prédit non viable basé sur la mécanique et contrôle-trié uniquement par la morphologie). La seule hypothèse émise par ce test est qu’aucun groupe (un « groupe » désigne soit les embryons ayant donné lieu à une naissance vivante, soit les embryons n’ayant pas donné lieu à une naissance vivante) ne contient moins de cinq échantillons. Cette hypothèse est satisfaite pour les deux comparaisons qui ont été effectuées (viable par rapport au contrôle, viable par rapport à non viable).
Pour déterminer les gènes présentant des différences d’expression significatives entre les embryons humains viables et non viables, les packages sva et edgeR de R ont été utilisés. Ces packages ont été bien validés pour être utilisés dans l’élimination des effets de lot et la détermination des différences significatives d’expression pour les données RNA-seq.
Un test de somme de rangs de Wilcoxon a été utilisé pour comparer la luminosité des granules corticaux entre les embryons (un test t n’a pas été utilisé car les échantillons avaient de faibles nombres et n’étaient pas normalement distribués selon le test de Lilliefors). Pour déterminer si l’injection de l’anticorps IP3 modifiait la rigidité moyenne de l’embryon, un test t bilatéral a été utilisé car il a été déterminé que les groupes injectés par l’anticorps et le groupe témoin étaient normalement distribués selon le test de Lilliefors. Un test de Kolmogorov-Smirnov à deux échantillons a été utilisé pour montrer que l’injection de l’anticorps provoquait un changement significatif dans la distribution des valeurs de rigidité. Des tests de somme de rangs de Wilcoxon ont été utilisés pour comparer les différences entre les quartiles des groupes ayant reçu l’injection d’anticorps et du groupe témoin, car il y avait très peu d’échantillons dans chaque quartile. Les tests de la somme des rangs de Wilcoxon ont également été utilisés pour tester la différence des valeurs médianes de la rigidité des ovocytes entre les stades GV, MI et MII car les valeurs de rigidité ne répondaient pas aux critères de normalité.