Mortalité et dysbiose dans différentes régions intestinales au cours de l’ontogenèse
La mortalité des autruches juvéniles s’est produite tout au long de la période d’étude de 12 semaines, mais était plus élevée entre 4 et 8 semaines d’âge, avec un pic à 6 semaines (Fig. 1b). Les individus malades ont suivi la courbe de croissance de tous les autres individus avant de perdre rapidement du poids avant leur mort (Fig. 1c, d). La cause de cette perte de poids est inconnue, mais on a observé que les individus malades cessaient de manger et de boire, et dans certains cas souffraient de diarrhée, donc la déshydratation et l’émaciation sont des explications probables. Au total, 40 % de tous les poussins sont morts d’une maladie suspectée (68/170, à l’exclusion de 60 témoins et de 4 individus blessés). Les autopsies des individus malades et des témoins ont révélé que la mortalité était associée à une inflammation étendue du tractus gastro-intestinal (Fig. 1e ; Figure S1). Les scores d’inflammation intestinale des individus malades (moyenne ± SD pour l’iléon = 3,1 ± 1,0, le cæcum = 2,0 ± 1,3, le côlon = 2,0 ± 1,2) étaient sensiblement plus élevés que ceux des individus témoins (iléon = 0,4 ± 1,0, cæcum = 0.04 ± 0,29, côlon = 0,08 ± 0,45) (Figure S1).
Types de mortalité des autruches jusqu’à 12 semaines d’âge. a Un des poussins d’autruche inclus dans l’étude à l’âge de 1 semaine. b La mortalité cumulée et le taux de mortalité par semaine. c, d Poids transformés en logarithme au fil du temps des individus témoins qui ont été sélectionnés au hasard pour être euthanasiés aux semaines 2, 4, 6, 8, 10 et 12 (lignes bleues en c), et des individus qui sont morts d’une maladie suspectée (lignes rouges en d). Les lignes grises illustrent les poids de tous les autres individus ayant survécu à l’ensemble de la période. e Photographies pendant la dissection illustrant une inflammation intestinale généralisée chez un individu malade (en bas) par rapport à un individu témoin (en haut)
La structure du microbiote des individus malades et des individus témoins était extrêmement différente dans les trois régions intestinales (figure 2, figure S2, tableau 1). Plus précisément, il y avait des différences significatives dans les distances de la communauté microbienne (obtenues avec les mesures de Bray-Curtis (BC) et UniFrac pondéré (wUF)) entre les individus malades et les individus témoins, en contrôlant l’âge, le sexe, le groupe et le temps depuis le décès (Tableau 1). Cependant, les mesures de Bray-Curtis et d’UniFrac pondéré ont révélé des modèles contrastés : Les distances de Bray-Curtis étaient les plus grandes dans l’iléon, diminuant vers l’intestin inférieur (cæcum-colon), tandis que les mesures UniFrac pondérées étaient les plus grandes dans le côlon, diminuant vers l’iléon (tableau 1). Le sexe, le groupe et le temps écoulé depuis le décès n’ont eu aucun effet significatif sur les mesures de distance du microbiome dans aucune des régions intestinales (tableau 1).
Plots d’analyse des coordonnées principales (PCoA) des dissimilarités de Bray-Curtis entre les microbiomes des individus témoins (bleu) et des individus malades (rouge). Les ellipses indiquent les intervalles de confiance à 90 %
De grandes différences ont également été constatées lors de l’examen de la variation des microbiomes chez les individus malades par rapport à la variation chez les individus témoins. Les individus malades étaient plus similaires entre eux dans le microbiome iléal que les témoins ne l’étaient entre eux en utilisant les distances de Bray-Curtis, mais pas les distances UniFrac pondérées (BC Multivariate homogeneity test of group dispersion (betadisper) : F1, 99 = 13,9, p = 0,0003. wUF betadisper : F1, 99 = 0,6, p = 0,46) (Figures S3-S4). En revanche, l’inverse était vrai dans le cæcum et le côlon (BC cecum betadisper : F1, 105 = 0,08, p = 0,79. BC colon betadisper : F1, 106 = 1,3, p = 0,25. wUF cecum betadisper : F1, 105 = 11,2, p = 0,001. wUF colon betadisper : F1, 106 = 11,4, p = 0,001) (Figure S3). Ensemble, ces résultats montrent que la composition bactérienne des individus malades et des individus témoins différait le plus dans l’iléon, mais que le côlon contenait les groupes les plus phylogénétiquement distincts.
Diversité alpha et dysbiose spécifique à l’âge dans différentes régions intestinales
La diversité alpha microbienne des individus malades était fortement réduite dans les trois régions intestinales par rapport aux témoins (GLMs maladie : iléon F1, 99 = 56,7, p = 2,5e-11 ; cæcum F1, 105 = 16,1, p = 0,0001 ; côlon F1, 106 = 61,5, p = 3,9e-12), en contrôlant l’âge (Fig. 3). Dans l’iléon, les différences ont persisté à tous les âges (GLM maladie*âge : F1, 97 = 0,0001, p = 0,99), et il y avait peu d’effets de l’âge, même chez les individus sains (GLM âge : F1, 98 = 1,4, p = 0,23). Dans le cæcum et le côlon, les individus malades présentaient une diversité alpha inférieure à celle des témoins aux âges précoces (Tableau 1 ; Fig. 3), mais ces différences diminuaient avec l’âge, la diversité augmentant généralement chez tous les individus (GLM maladie*âge : cæcum F1, 103 = 10,2, p = 0,002 ; côlon F1, 104 = 9,1, p = 0,003). Les réductions de la diversité alpha associées à la maladie étaient donc évidentes dans tout l’intestin à des âges précoces, mais étaient limitées à l’iléon à des âges plus avancés (voir aussi ).
Diversité alpha (indice de Shannon) au cours du développement dans l’iléon, le cæcum et le côlon. Les individus témoins sont représentés en bleu et les individus malades en rouge. Les lignes affichent les courbes de lissage de régression locale ajustées et les zones ombrées l’intervalle de confiance à 95%. Le panneau inférieur droit montre toutes les valeurs de diversité alpha ensemble
Taxa associé à la maladie dans l’iléon
Pour mieux comprendre les dissemblances microbiennes entre les individus malades et les individus témoins, nous avons évalué la composition taxonomique de toutes les régions gastro-intestinales. L’iléon a montré les preuves les plus frappantes de dysbiose (Fig. 4). Les individus témoins présentaient une communauté diversifiée de différentes classes bactériennes dans l’iléon, alors que les individus malades présentaient une prolifération de Gammaproteobacteria et une réduction majeure de Bacilli et d’autres classes plus rares. Une étude détaillée des familles appartenant aux Gammaproteobacteria a montré une dominance presque complète des Enterobacteriaceae dans les échantillons d’iléon malades, alors que les individus témoins hébergeaient un ensemble diversifié de familles de Gammaproteobacteria (Figure S5).
La proportion de classes bactériennes par individu et par région intestinale, triée par âge (barres de gauche = plus jeune, barres de droite = plus vieux). Colonne de gauche = individus témoins, colonne de droite = individus malades. Rangée du haut = iléon, rangée du milieu = cæcum, rangée du bas = côlon
Les Enterobacteriaceae Gram-négatives sont une grande famille bien connue pour englober plusieurs pathogènes et pathobiontes intestinaux, et sont fréquemment observées en plus grande abondance chez les hôtes présentant une dysbiose intestinale . Il y avait 19 unités taxonomiques opérationnelles (UTO ; séquences avec une identité nucléotidique de 100 %) associées aux Enterobacteriaceae dans l’iléon, et des recherches de type blast contre la base de données nucléotidiques du NCBI ont permis d’établir une correspondance avec un large éventail de genres, dont Escherichia, Klebsiella, Shigella, Salmonella, Yokenella, Citrobacter, Enterobacter, Cronobacter, Atlantibacter, Pluralibacter, Leclercia et Kluyvera. Dans des études antérieures, il a été montré que divers membres de la famille des Enterobacteriaceae cooccurrent souvent et fleurissent simultanément pendant la dysbiose , ce qui est cohérent avec nos résultats.
Une autre caractéristique clé de la dysbiose dans l’iléon était que certains individus avaient des microbiomes presque entièrement composés de Clostridia, un modèle qui n’a été observé chez aucun individu témoin (Figure 4). Les familles de Clostridia présentaient d’autres caractéristiques taxonomiques frappantes chez les individus malades, notamment une augmentation importante des Peptostreptococcaceae et une réduction marquée des Ruminococcaceae et d’autres familles rares (Figure S5). La famille des Peptostreptococcaceae était représentée par six OTU dans nos données, et les recherches de type blast ont permis d’obtenir des correspondances avec diverses espèces de Paeniclostridium, Paraclostridium et Clostridium. La plus prévalente de ces OTU correspondait à Paeniclostridium sordellii, une bactérie connue pour avoir des souches virulentes causant une morbidité et une mortalité élevées par entérite et entérotoxémie chez les humains et les animaux .
Puis, nous avons identifié des OTU spécifiques associées à la dysbiose en effectuant des tests binomiaux négatifs de Wald des abondances bactériennes, tout en contrôlant l’âge des hôtes. Trente-huit OTU étaient significativement surreprésentées dans l’iléa des individus malades (Fig. 5), dont la plupart appartenaient aux Clostridia, y compris Ruminococcaceae, divers Clostridium spp, et Epulopiscium, mais aussi Bacteroides, Escherichia, et Bilophila wadsworthia (tableau S1).
Les OTUs différemment abondantes (q < 0.01) entre les individus témoins et malades, séparés pour les trois régions intestinales. Les axes y montrent les familles taxonomiques et les OTUs ont été colorés au niveau de la classe. Les changements de plis log2 positifs indiquent une plus grande abondance des OTU chez les individus témoins et les changements de plis log2 négatifs indiquent une plus grande abondance chez les individus malades. NA = OTUs sans classification de famille
Taxa associé à la maladie dans le cæcum et le côlon
L’examen des abondances relatives des classes bactériennes dans le cæcum et le côlon a montré que les individus témoins étaient largement similaires, présentant une composition du microbiome relativement stable à travers les hôtes et les âges. Cependant, la composition microbienne des deux régions intestinales a subi des perturbations majeures chez les individus malades (Fig. 4). Comme dans l’iléon, les Gammaprotéobactéries étaient plus répandues dans le cæcum et le côlon des individus malades, mais une réduction des Clostridia et une augmentation des Bacteroidia constituaient les différences les plus importantes. D’autres analyses taxonomiques des Bacteroidia ont montré que la famille des Porphyromonadaceae avait proliféré dans le cæcum et le côlon des individus malades (Figure S5). Cette famille comprenait deux espèces dans nos données, Parabacteroides distasonis et Dysgonomonas sp. qui sont couramment trouvées dans le microbiote intestinal normal. Cependant, P. distasonis a été précédemment identifié comme une espèce favorisant la colite chez les souris et les membres de Dysgonomonas sont connus pour être associés à la cachexie et à l’inflammation intestinale .
Les tests d’abondance différentielle ont identifié de grandes similitudes dans les schémas de dysbiose du cæcum et du côlon, car 50 des 56 (89 %) OTU qui étaient plus abondantes dans les échantillons de côlon malades étaient également plus abondantes dans les échantillons de cæcum malades (figure 5 ; tableaux S2-S3). En outre, 15 de ces OTU (39%) étaient également significativement surreprésentés dans l’iléon (Tableau S1). L’OTU le plus significatif dans le cæcum (q = 1,2e-53) et le côlon (q = 2,4e-56) était absent chez les individus témoins mais abondant chez les individus malades (Tableaux S2-S3). Cet OTU, qui était également très significatif dans l’iléon (q = 3,4e-21), présentait une correspondance à 100 % avec Clostridium paraputrificum, un pathogène humain connu associé à la septicémie et à l’entérocolite nécrosante. C. paraputrificum a également été étudié expérimentalement chez des cailles gnotobiotiques, où il a provoqué des lésions et des hémorragies dans la muqueuse intestinale associées à l’entérocolite .
En dehors de C. paraputrificum, des OTU hautement significatives qui étaient plus abondantes chez les individus malades (tableaux S2-S3) ont donné des correspondances de souffle (99.5-100% d’identité) aux espèces de Clostridium C. colinum, C. cadaveris, C. butyricum et C. perfringens, qui ont toutes été précédemment liées à l’entérocolite aiguë chez l’autruche et d’autres animaux. D’autres OTU fortement surreprésentées dans les échantillons de cæcum et de côlon malades appartenaient aux Enterobacteriaceae, Ruminococcaceae, Mogibacteriaceae, Bacteroides, Dorea, Sedimentibacter, Bilophila wadsworthia et Eggerthella lenta (Fig. 5 ; Tableaux S2-S3). Beaucoup de ces bactéries font partie du microbiote intestinal normal et la majorité de tous les OTUs significativement surreprésentés chez les individus malades étaient également présents chez certains individus témoins, bien qu’à des abondances beaucoup plus faibles (tableaux S2-S3).
Taxa associé à la santé dans différentes régions de l’intestin
L’iléon des individus malades présentait de fortes réductions de certaines bactéries par rapport aux témoins (Fig. 4), principalement des Bacilli, une classe dans laquelle les Turicibacteraceae et les Lactobacillaceae étaient les familles les plus fréquentes. Turicibacteraceae comprenait deux OTUs significatifs de Turicibacter (Tableau S1), qui ont montré des abondances réduites dans l’iléa malade. Il a été démontré que Turicibacter est hautement héréditaire chez les humains et les souris où il est en contact direct avec les cellules hôtes de l’intestin grêle. Ce genre a été associé à la fois à la santé et à la maladie, mais on constate souvent qu’il est appauvri chez les animaux atteints de diarrhée et d’entéropathie .
L’une des différences les plus frappantes dans le cæcum et le côlon des individus malades était une réduction substantielle de la famille Bacteroidia, S24-7 (figure S5). On sait peu de choses sur S24-7, bien qu’il s’agisse d’un composant important du microbiote intestinal normal des vertébrés. Néanmoins, des études menées sur des souris ont signalé un effet potentiellement bénéfique de S24-7, dont l’abondance est souvent réduite chez les hôtes malades . La majorité des OTU dont l’abondance était réduite dans le côlon des individus malades étaient également sous-représentées dans le cæcum (15 sur 19 ; 79 %), ce qui indique une diminution à grande échelle des bactéries potentiellement associées à la santé dans l’intestin postérieur. Ces OTUs appartenaient à des taxons tels que Lachnospiraceae (par exemple, Coprococcus, Blautia), Ruminococcaceae (par exemple, Ruminococcus), S24-7, Erysipelotrichaceae, Clostridium, Anaeroplasma, Turicibacter, Methanobrevibacter, Akkermansia muciniphila, et plusieurs Clostridiales inconnus (Fig. 5 ; Tableaux S2-S3).
Alors que 15 OTU se sont avérés être significativement surreprésentés dans les trois régions intestinales des individus malades, un seul OTU était significativement sous-représenté dans toutes les régions intestinales des individus malades. Cet OTU correspondait au genre Roseburia, producteur de butyrate, qui a été associé à plusieurs reprises à la santé. Par exemple, des abondances plus faibles de Roseburia spp. ont été découvertes chez des humains souffrant de colite ulcéreuse, de maladies inflammatoires de l’intestin, du syndrome du côlon irritable, d’obésité, d’encéphalopathie hépatique et de diabète de type 2, ainsi que chez des porcs atteints de dysenterie porcine. Ces résultats soutiennent l’idée que Roseburia et de nombreux autres taxons précédemment trouvés pour être négativement associés à la maladie, ne sont pas seulement spécifiques aux modèles de dysbiose des mammifères, mais leur déplétion est une caractéristique unificatrice de la dysbiose à travers des hôtes phylogénétiquement distants tels que les humains et les autruches.
Désorganisation du microbiote intestinal dans les semaines précédant la mort
Pour établir si la dysbiose se produit immédiatement avant la mort ou résulte de déséquilibres émergeant plus tôt dans la vie, nous avons examiné le microbiote d’échantillons fécaux prélevés à plusieurs reprises avant la mort. Nous avons constaté que la survie des poussins jusqu’à l’âge de 4 semaines n’était pas liée à la diversité alpha ou phylogénétique des bactéries plus tôt dans la vie (Tableau S4). Cependant, la probabilité de survivre au-delà de six semaines était prédite par une diversité alpha plus élevée à l’âge de 2 semaines (rapport de risque (HR) de Cox : 0,57±0,25, p < 0.05), mais une diversité alpha plus faible à l’âge de 4 semaines (HR : 4,02±0,59, p < 0,05), et une diversité phylogénétique plus faible à l’âge de deux et quatre semaines (HR 2 semaines : 1,40±0,15, p < 0,05 ; HR 4 semaines : 1,88±0,24, p < 0,01) (figure S6 ; tableau S4). Ces résultats suggèrent que les individus présentant une faible diversité microbienne alpha à l’âge de 2 semaines étaient susceptibles d’être colonisés par des groupes phylogénétiques distincts de bactéries, ce qui augmentait leur risque de mortalité dans les semaines suivantes.
Puis, nous avons examiné si les abondances des familles bactériennes qui différaient entre les individus malades et les individus témoins pouvaient prédire les modèles de mortalité future dans les semaines précédant le décès. Il n’y avait que de faibles preuves que le fait d’avoir des abondances plus élevées de Lactobacillaceae à l’âge de 2 semaines et de Turicibacteraceae à l’âge de 4 semaines avait tendance à influencer positivement la survie (figure S7 ; tableau S4). Les abondances de Peptostreptococcaceae et de S24-7 au-delà de 6 semaines d’âge étaient également associées à une augmentation de la survie ultérieure, bien que de manière non significative (Tableau S4). Cependant, il y avait des associations très fortes entre les abondances de Peptostreptococcaceae et de S24-7 pendant la première semaine de vie et la mortalité à tous les âges suivants, même après avoir contrôlé les abondances de ces familles bactériennes aux âges ultérieurs (Peptostreptococcaceae HR range : 1,65±0,13 à 1,73±0,16, toutes les valeurs p < 0,001 ; S24-7 HR range : 1,24±0,11 à 1,60±0,21, toutes les valeurs p < 0,05) (Fig. 6 ; Tableau S4). Ce résultat suggère que le moment de la prolifération de certains groupes bactériens, tels que les Peptostreptococcaceae et les S24-7, peut être la clé de la condition physique de l’hôte, des abondances plus élevées pendant les âges précoces pouvant avoir des effets néfastes même si les mêmes groupes bactériens peuvent être bénéfiques à des âges plus avancés. Cela soutient également l’idée que les deux premiers jours après l’éclosion sont une période critique déterminant si des déséquilibres microbiens s’ensuivent, ce qui peut conduire à une mortalité accrue même des mois plus tard.
Abondances (normalisées et log-transformées) de deux familles bactériennes associées à la maladie dans les semaines précédant le décès, mesurées par des prélèvements fécaux répétés sur les individus. Les points et les barres d’erreur représentent les moyennes ± SE
Sources environnementales des bactéries intestinales
Enfin, nous avons évalué les sources environnementales potentielles des microbes présents dans l’intestin des individus témoins et malades. Des échantillons ont été prélevés dans l’eau, les aliments et le substrat du sol pendant la période d’étude et analysés avec SourceTracker . La contribution de l’eau (0,1-0,4 %) ou du sol (0,2-0,7 %) au microbiote intestinal des individus malades ou témoins était pratiquement nulle (Fig. 7). Au contraire, la majorité des bactéries intestinales provenaient de sources inconnues (89,9 %). Certaines séquences microbiennes présentes dans les aliments chevauchaient les OTUs trouvées dans l’iléon et le côlon. Cependant, ces séquences étaient principalement présentes chez les individus témoins, ce qui peut s’expliquer par le fait que les individus en bonne santé mangent plus que les individus malades (Fig. 7). Ces résultats indiquent que les aliments ou l’eau contaminés étaient des sources peu probables de bactéries associées à la mortalité.
Sources environnementales des bactéries présentes dans les différentes sections intestinales. C = individus témoins et D = individus malades
Notre schéma d’échantillonnage environnemental n’exclut pas la possibilité qu’il existe d’autres sources environnementales de bactéries pathogènes. Par exemple, plusieurs espèces d’oiseaux sauvages, y compris des moineaux du Cap, des tisserands du Cap, des tisserands masqués, des fous rouges et des quéléas ont été fréquemment observés dans les enclos extérieurs des poussins. L’échantillonnage de l’eau, de la nourriture et du sol toutes les deux semaines n’était peut-être pas assez fréquent pour détecter la présence transitoire potentielle de bactéries dans l’environnement ou les événements de transmission qui peuvent se produire sporadiquement. Néanmoins, nos analyses longitudinales du microbiome fécal suggèrent que les problèmes de dysbiose surviennent tôt dans la vie à partir de taxons déjà présents dans l’intestin, plutôt que par l’acquisition soudaine de nouveaux taxons. On sait peu de choses sur les microbiomes des œufs, des parents ou de l’environnement d’éclosion de cette espèce, mais il s’agit là d’une piste évidente pour de futures recherches qui pourraient aider à identifier des moyens de contrôler la prévalence de bactéries problématiques au début de la vie. Pour cette étude, les poussins ont été élevés en étant isolés des adultes car cela facilite la gestion et la manipulation. Cependant, cette approche empêche les interactions entre les poussins et les parents qui peuvent être importantes pour l’établissement précoce du microbiote intestinal. Par exemple, il a été démontré que la coprophagie (se nourrir de matières fécales) est importante pour le développement du microbiote chez d’autres animaux et les poussins d’autruches sont connus pour être coprophages. L’accès aux adultes (ou au moins à leurs excréments) peut permettre aux poussins d’ensemencer leur microbiome tôt dans la vie avec une communauté bactérienne équilibrée et diversifiée, empêchant peut-être la prolifération future de bactéries problématiques. Cette idée, cependant, reste à être testée expérimentalement.