En 1993, mientras Santoro estudiaba Periodismo en la PUC-Rio, entró en el Taller de Actores de la Rede Globo. Santoro interpretó papeles en muchas telenovelas de Globo, como Olho no Olho (1993), Pátria Minha (1994), Explode Coração (1995), O Amor Está no Ar (1997), Suave Veneno (1999) y Mulheres Apaixonadas (2003), así como en la miniserie Hilda Furacão (1998), en el papel de un sacerdote. Santoro también fue el actor de voz del personaje titular de Stuart Little y su secuela en las copias dobladas brasileñas.
Su primer papel importante en una producción cinematográfica llegó en 2001, con Bicho de Sete Cabeças (Tormenta de ideas), del director brasileño Laís Bodansky. Al final de la película, recibió una gran ovación del público. También ganó el trofeo al mejor actor del festival. Después de Bicho, su reputación como actor se había consolidado y fue elegido como protagonista masculino de Abril Despedaçado (Detrás del sol), una de las nominadas a la mejor película extranjera en los Globos de Oro de 2002. En la película de Héctor Babenco de 2003, Carandiru, interpretó a Lady Di, una prisionera transexual.
El director canadiense Robert Allan Ackerman fichó a Santoro para su producción televisiva La primavera romana de la señora Stone, tras quedar fascinado por su actuación en Bicho de Sete Cabeças. Como Santoro no tenía agente en Norteamérica, Ackerman se puso en contacto con el padre de Santoro. Pasó dos meses rodando en Roma, junto a actores de renombre como Helen Mirren y Anne Bancroft. Poco después de terminar el rodaje de Mrs. Stone, recibió una oferta de Columbia Pictures para un papel en la superproducción Los Ángeles de Charlie: A todo gas. Su actuación en Los ángeles de Charlie impulsó su carrera en Hollywood. Después de Los ángeles de Charlie, interpretó el personaje de Karl, el enigmático diseñador jefe e interés amoroso del personaje de Laura Linney, en la comedia romántica Love Actually, en la que también aparecen Colin Firth, Lucía Moniz, Hugh Grant, Emma Thompson, Keira Knightley y Rowan Atkinson.
También empezó a tener trabajo en el mundo de la publicidad, ya que apareció en una campaña comercial con Gisele Bündchen en 2002. Interpretó al protagonista masculino de No. 5 The Film, el anuncio de 3 minutos de duración para Chanel, dirigido por Baz Luhrmann junto a Nicole Kidman en 2004.
En 2006, Santoro se unió al reparto de Lost como el superviviente del vuelo 815 de Oceanic, Paulo. Su primera aparición fue en el episodio titulado «Further Instructions». Su personaje fue asesinado en el episodio «Exposé». También pone voz a su personaje Paulo en el doblaje portugués para Brasil.
Santoro fue elegido para interpretar al emperador persa Jerjes en la película 300, basada en el cómic de Frank Miller del mismo nombre, en 2006. El papel tenía muchos requisitos especiales, como un entrenamiento intensivo para el físico del papel (Santoro había perdido 24 libras para trabajar en una miniserie brasileña), un extenso trabajo de CG para retratar a Santoro de 1,80 metros como el Dios-Rey de 2 metros, un proceso de aplicación de maquillaje de cuatro horas y media y la eliminación completa del vello corporal de Santoro, primero con cera y luego afeitándose cuando eso resultó demasiado doloroso. Sin embargo, sus cejas se mantuvieron intactas, cubiertas con prótesis y dibujadas en lugar de ser afeitadas. Santoro leyó las obras de Heródoto, un historiador de la antigua Grecia, para preparar su papel. Respecto a Jerjes, ha declarado:
Es rico, es arrogante, es un megalómano muy inestable. Sólo quiere conquistar el mundo. Su ambición es ilimitada. Quiere la gloria; quiere la victoria; quiere la fama eterna. Sin embargo, debajo de todo ese deseo, es en última instancia débil y muy inseguro.
Por su papel en 300, Santoro se convirtió en el primer actor brasileño nominado a los MTV Movie Awards en la categoría de Mejor Villano. Sin embargo, no ganó y el premio fue para Jack Nicholson por Los infiltrados.
Interpretó al fallecido futbolista Heleno de Freitas en la película Heleno de 2012. Santoro coprotagonizó junto a Arnold Schwarzenegger la película de 2013 El último desafío. Santoro interpretó a Garriga en la película dramática de Will Smith Focus (2015).
Santoro interpretó a Jesús en la película de acción histórica de 2016 Ben-Hur y recibió la bendición personal del Papa Francisco para este papel.