Matlin debutó en el escenario a los siete años como Dorothy en un teatro infantil del Centro Internacional de la Sordera y las Artes (ICODA) de El Mago de Oz, y siguió apareciendo con el grupo de teatro infantil del ICODA durante toda su infancia.
Su descubrimiento por parte de Henry Winkler durante una de sus representaciones teatrales en el ICODA la llevó a debutar en el cine en Hijos de un dios menor (1986). La película recibió críticas generalmente positivas y la interpretación de Matlin como Sarah Norman, una mujer sorda reacia a hablar que se enamora de un hombre oyente, recibió grandes elogios: Richard Schickel, de la revista TIME, escribió: «Tiene un talento inusual para concentrar sus emociones -y las del público- en sus señas. Pero hay algo más aquí, una inteligencia irónica, un ingenio feroz pero no distante, que el cine, con su famosa capacidad de fotografiar el pensamiento, descubre en muy pocas interpretaciones.» Roger Ebert, del Chicago Sun-Times, también quedó impresionado con Matlin, escribiendo: «Se mantiene a la altura de la potencia con la que actúa, llevando las escenas con una pasión y un miedo casi doloroso a ser rechazada y herida, que es en realidad de lo que trata su rebelión», y Paul Attasanio, del Washington Post, dijo: «El reto más obvio del papel es comunicar sin hablar, pero Matlin lo supera de la misma manera que lo hacían las estrellas de la era muda: actúa con sus ojos, sus gestos.» Hijos de un dios menor le valió un Globo de Oro a la mejor actriz de drama y un Oscar a la mejor actriz. Con tan sólo 21 años, Matlin sigue siendo la actriz más joven en recibir el Oscar en la categoría de Mejor Actriz; sigue siendo la única sorda galardonada con el premio de la Academia en cualquier categoría.
Dos años más tarde, hizo una aparición en Barrio Sésamo con Billy Joel interpretando una versión revisada de «Just the Way You Are» con letra de Tony Geiss. Matlin utilizó el lenguaje de signos durante la canción y abrazó a Oscar el Gruñón durante la conclusión de la misma. Un año después, Billy Joel la invitó a actuar en su vídeo para «We Didn’t Start the Fire».
En 1989, Matlin interpretó a una viuda sorda en la película para televisión Bridge to Silence. En ese papel, además de utilizar el lenguaje de signos, hablaba. A la revista People no le gustó la película, pero alabó el trabajo de Matlin, escribiendo: «la bella y emotiva Matlin es demasiado buena para esta bazofia bienintencionada pero sentimental.» Fue nominada a un Globo de Oro por su trabajo como protagonista femenina en la serie de televisión Dudas razonables (1991-1993). Matlin fue nominada a un premio Emmy por una aparición como invitada en Picket Fences (1992) y se convirtió en una habitual de esa serie durante su última temporada (1996). Interpretó a Carrie Buck en el drama televisivo de 1994 Against Her Will: La historia de Carrie Buck, basada en el caso de 1927 del Tribunal Supremo de Estados Unidos Buck contra Bell 274 U.S. 200. En ese papel, Matlin interpretó a una mujer oyente por primera vez en su carrera, lo que le valió una nominación al CableACE como mejor actriz. Tuvo un destacado papel secundario en el drama It’s My Party (1996).
Matlin tuvo posteriormente papeles recurrentes en The West Wing, y Blue’s Clues. Otras apariciones en televisión incluyen Seinfeld («The Lip Reader»), The Outer Limits («The Message»), ER, The Practice, y Law & Order: Unidad de Víctimas Especiales. Fue nominada a los premios Emmy por sus apariciones como invitada en Seinfeld, La ley & Orden: Unidad de Víctimas Especiales, y The Practice.
En 2002, Matlin publicó su primera novela, titulada Deaf Child Crossing, que se basaba libremente en su propia infancia. Más tarde escribió y publicó una secuela titulada Nobody’s Perfect (Nadie es perfecto), producida en el escenario del Centro de Artes Escénicas John F. Kennedy en colaboración con VSA Arts en octubre de 2007. En 2004, protagonizó la película ¿Qué coño sabemos? como Amanda. También en 2003, fue la anfitriona del 3er Festival Anual de Cine para Sordos en Chicago.
En 2006, interpretó a una madre sorda en Mujeres Desesperadas. Tuvo un papel recurrente en Me llamo Earl como defensora pública de Joy Turner (que hizo muchas bromas sobre la sordera de Matlin a costa de ésta), e interpretó a la madre de una de las víctimas en un episodio de CSI: NY. Ese mismo año, Matlin participó en la cuarta temporada de The L Word como Jodi Lerner, una escultora lesbiana. Apareció en la cuarta temporada (2007), en la quinta (2008) y en la sexta (2009) como la novia de una de las protagonistas de la serie, Bette Porter, interpretada por Jennifer Beals.
El 4 de febrero de 2007 y el 7 de febrero de 2016, Matlin interpretó el «Star Spangled Banner» en lenguaje de signos americano en la Super Bowl XLI en Miami, Florida, y en la Super Bowl 50 en Santa Clara, California, respectivamente. En enero de 2008, apareció en Nip/Tuck como ejecutiva de televisión.
En 2008, Matlin participó como competidora en la sexta temporada de Dancing with the Stars de ABC. Su pareja de baile fue el recién llegado Fabián Sánchez. Matlin y Sánchez fueron la sexta pareja eliminada de la competición.
El 6 de mayo de 2009, Matlin recibió una estrella en el Paseo de la Fama de Hollywood.
El 8 de noviembre de 2009, Matlin apareció en el programa de Seth & Alex’s Almost Live Comedy Show, presentado por Seth MacFarlane y Alex Borstein. Después de que Borstein imitara a Matlin llamando a MovieFone y cantando «Poker Face», la propia Matlin apareció y lanzó una cómica diatriba contra Borstein por haberse burlado de ella, y por no haber sido invitada a poner su propia voz para Padre de familia. Matlin pasó a poner voz a Stella, la compañera de trabajo de Peter Griffin, en el episodio de la 10ª temporada «The Blind Side»; Stella se convirtió más tarde en un personaje recurrente.
En 2010, Matlin produjo un piloto para un reality show que tituló My Deaf Family (Mi familia sorda), que presentó a varios ejecutivos de cadenas nacionales. Aunque expresaron su interés, ninguna cadena compró los derechos del programa. El 29 de marzo de 2010, Matlin subió el piloto a YouTube y lanzó una campaña de marketing viral.
El 26 de julio de 2010, Matlin firmó un discurso en un evento que conmemoraba el 20º aniversario de la Ley de Estadounidenses con Discapacidades.
Al año siguiente, Matlin fue finalista en el programa de la NBC The Celebrity Apprentice, compitiendo para ganar dinero para su organización benéfica, The Starkey Hearing Foundation, quedando en segundo lugar. Sin embargo, en un episodio de The Celebrity Apprentice, «The Art of the Deal», que se emitió el 3 de abril de 2011, recaudó más fondos de los que nunca se habían recaudado para la caridad en un solo evento en cualquier programa de televisión antes, 986.000 dólares. Donald Trump, que por aquel entonces presentaba The Celebrity Apprentice, donó entonces 14.000 dólares más para que la aportación fuera incluso de un millón.
En 2013, Matlin se interpretó a sí misma en No Ordinary Hero: The SuperDeafy Movie. A partir de enero de 2015, Matlin también actuó como embajadora de celebridades de la ACLU en favor de los derechos de los discapacitados.
Como «embajadora de celebridades» de la ACLU, en un intento de salvar la brecha entre las fuerzas del orden y la comunidad de sordos, Matlin habló de las barreras de comunicación cuando los individuos sordos son detenidos por la policía.
Matlin interpretó el personaje recurrente de Melody Bledsoe en Switched at Birth. En septiembre de 2015, debutó en Broadway en la producción de reposición del musical Spring Awakening.
A partir de 2017, Matlin interpretó el papel recurrente de Harriet en la serie de televisión de Syfy, The Magicians.
El 31 de julio de 2017, se anunció por Deadline que Matlin se unió como serie regular en la tercera temporada del thriller de ABC Quantico. Protagonizó el papel de la ex agente del FBI Jocelyn Turner.
En 2019, Marlee Matlin fue mencionada en un artículo de Hearing Like Me como alguien que podría aportar más #TalentoSordo a «Life and Deaf», una nueva serie de comedia que pretende explorar la vida de un niño con padres sordos. La nueva serie, ambientada en los años 70, estará protagonizada por la premiada actriz y activista sorda Marlee Matlin. Este espectáculo iba a ser producido ejecutivamente por Marlee Matlin, según Deadline.