Todos hemos oído hablar de la centrifugación, o más concretamente, de las historias de terror asociadas a la centrifugación que sale mal, como en el caso del famoso accidente de centrifugación de Cornell. La mayoría de los errores relacionados con la centrifugación se deben a una mala manipulación por parte del usuario. Por lo tanto, es crucial entender por qué hacemos lo que hacemos durante la centrifugación para evitar daños a la máquina y al personal. A continuación, he enumerado algunos de los problemas más comunes que pueden pasarse por alto fácilmente durante la centrifugación y por qué son tan importantes para el manejo adecuado de una centrífuga.
Todo es cuestión de equilibrio
La centrifugación produce fuerzas centrífugas para separar eficazmente los componentes de la muestra en función del tamaño y la densidad. Pequeños desequilibrios de peso pueden causar vibraciones anormales que pueden dañar el rotor. Una centrífuga desequilibrada es tan peligrosa como una reacción química inestable. No sólo puede dañar el instrumento, sino que también puede iniciar un efecto dominó de catástrofes que van desde el fallo del instrumento, hasta la rotura de la muestra que podría liberar contaminantes potencialmente dañinos en el medio ambiente (muestras infecciosas, aerosoles dañinos, etc.), y las lesiones del usuario, en general, lo que resulta en una destrucción a gran escala y supone un gran peligro para la seguridad.
A) La necesidad de un equilibrio preciso a altas velocidades
El equilibrio preciso es crucial durante las centrifugaciones de alta velocidad. Para entenderlo mejor, tenemos que volver a algunos conceptos básicos de física. Según la segunda ley de Newton, la fuerza (F) es igual a la masa (M) por la aceleración (A). Así, la fuerza centrífuga generada durante el centrifugado es directamente proporcional a la masa de la muestra y a la aceleración. Durante el movimiento circular, la aceleración está relacionada con la velocidad de rotación y el radio del rotor. A altas velocidades, incluso ligeras variaciones en la masa de la muestra pueden conducir a un desequilibrio sustancial de la fuerza, que podría ser catastrófico.
B) Equilibrado basado en el tipo de rotor
Independientemente de si la centrífuga tiene un rotor de ángulo fijo o de cubo oscilante, dos factores importantes a tener en cuenta a la hora de equilibrar son el volumen de la muestra y la disposición simétrica de los tubos. Es importante asegurarse de que los volúmenes de la muestra sean iguales en todos los tubos y que éstos se coloquen directamente uno frente al otro en la centrífuga. Si el número de tubos es desigual, hay que equilibrarlo añadiendo un tubo adicional lleno de agua con el mismo volumen que los tubos experimentales. Si las soluciones no tienen una densidad similar (por ejemplo, acetona y agua), los tubos deben tener la misma masa que el volumen para estar correctamente equilibrados. Un factor adicional a tener en cuenta en el caso de los rotores de cubo oscilante es asegurarse de que todas las ranuras contienen cubos de rotor adecuados a la máquina y del mismo peso.
2. FCR vs. RPM y por qué es importante
La FCR (fuerza centrífuga relativa o fuerza g) y las RPM (revoluciones por minuto) se utilizan comúnmente para describir la velocidad centrífuga. Sin embargo, estas unidades son completamente diferentes. Las RPM denotan la velocidad de rotación, que depende del radio del rotor. La FCR denota la fuerza centrífuga sobre las muestras y tiene en cuenta tanto el radio del rotor como la velocidad de rotación. La misma FCR puede lograrse en centrífugas con diferentes tamaños de rotor ajustando adecuadamente las RPM. Esto hace que la FCR sea la unidad idónea para describir las velocidades centrífugas, ya que puede compararse entre centrifugadoras, mientras que las RPM sólo son constantes para centrifugadoras con el mismo radio de rotor. En pocas palabras, RPM no es igual a RCF, y los ajustes de velocidad de RPM deben convertirse a RCF para garantizar que se aplique la fuerza centrífuga correcta.
3. Tiempo, velocidad y centrifugación
La elección de la velocidad de centrifugación depende del tamaño y la fragilidad de las partículas de la muestra. Cuanto menor sea el tamaño de las partículas, mayor será la velocidad de centrifugación. Por ejemplo, las células bacterianas se pelean a velocidades más altas (2000-10.000 x g) que las células de mamíferos (500-2000 x g). Además, se pueden utilizar velocidades de centrifugación más bajas con muestras más frágiles.
Otro factor crítico que influye en la eficiencia de la separación es la FCR. El RCF es proporcional al radio del rotor y al cuadrado de las RPM. Debido a esta dependencia cuadrada de la FCR con respecto a las RPM, las velocidades de centrifugación de 1000 RPM durante 5 minutos y 500 RPM durante 10 minutos no son intercambiables. La primera produce una FCR mucho mayor que la segunda. Por lo tanto, es importante tener en cuenta la FCR al determinar la velocidad y el tiempo para su centrifugación.
4. Centrifugación a diferentes temperaturas
La centrifugación genera calor, que puede aumentar la temperatura dentro de una centrífuga (a veces, en más de 15°C). Esto puede afectar a la estabilidad de las muestras sensibles a la temperatura. En estos casos, se suelen preferir las centrífugas refrigeradas. Sin embargo, también se pueden mantener temperaturas constantes en una centrífuga de ambiente. La temperatura de la muestra durante la centrifugación está influenciada principalmente por tres factores: el material del rotor, la forma del rotor y la velocidad de rotación.
A) Material del rotor
Durante la centrifugación, la temperatura puede verse influenciada por la conductividad térmica del material del rotor. Los rotores hechos de metal, como el acero y el aluminio, tienen una alta densidad y una alta conductividad térmica. Transmiten el calor de forma eficiente y se enfrían rápidamente. Por el contrario, materiales como los polímeros y las fibras de carbono son aislantes del calor y mantienen una temperatura constante.
B) Forma del rotor
La forma del rotor determina el flujo de aire dentro de una centrífuga, de forma similar a como las aspas de un ventilador eléctrico influyen en el flujo de aire dentro y fuera de la máquina. Optimizar el flujo de aire dentro de una centrífuga a través de la forma del rotor es esencial para mantener la temperatura.
C) Velocidad
La velocidad de rotación es directamente proporcional al aumento de la temperatura: a mayor velocidad, se genera más calor. Es importante conocer la velocidad máxima de la centrífuga y el rango de velocidades que mantienen un rango de temperatura que no cambiará el resultado del experimento. Por lo general, esta información será proporcionada por el fabricante en el manual del equipo para ayudar al usuario a entender las limitaciones y trabajar alrededor de ella.
5. Frenar o no frenar
Durante la centrifugación, la separación de los componentes de la muestra continúa durante la fase de desaceleración. Muchas centrífugas ofrecen la opción de controlar los ajustes de desaceleración (frenos) para que se detenga más rápidamente, pero ¿cuándo necesitamos realmente esta opción y cuál es el efecto sobre los resultados de la muestra?
El frenado puede ser especialmente útil durante las centrifugaciones que implican extracciones de ácidos nucleicos o la peletización de células bacterianas, que no se ven afectadas por una parada repentina. Sin embargo, para los experimentos que son más sensibles a la desaceleración brusca, como el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica y las centrifugaciones en gradiente, el frenado puede hacer que las capas separadas se vuelvan a mezclar. En estos casos, es más conveniente desactivar el freno para que la desaceleración sea gradual y no perturbe los gradientes. Algunas centrífugas ofrecen una gama de ajustes de desaceleración. Esto puede ser útil cuando se centrifugan células de mamíferos, que son sensibles a las desaceleraciones repentinas pero, al mismo tiempo, requieren cierta desaceleración para minimizar el tiempo que tarda la centrífuga en detenerse.
6. ¿Dónde está el pellet?
Una de las aplicaciones más comunes de la centrifugación es el pellet de muestras, como células bacterianas, células de mamíferos o ácidos nucleicos. Cuando se utiliza un rotor de ángulo fijo, el ángulo del rotor determina la posición del pellet. Para asegurarse de saber siempre dónde está el pellet, una buena práctica de laboratorio es girar siempre los tubos con las bisagras de la tapa colocadas en la misma orientación (por ejemplo, las bisagras de la tapa mirando hacia fuera). Esto es especialmente útil para evitar la pérdida de muestras durante las extracciones de ADN cuando el pellet es casi invisible tras el paso de lavado con etanol. En el caso de los rotores de cubeta oscilante, los pellets se forman sobre todo en el fondo del tubo.
En general, espero que la lectura de este artículo le ayude a trabajar con más comodidad y confianza con las centrífugas. Si has visto o vivido un desastre con las centrífugas, anímate y comparte tu historia junto con algún consejo o truco para asegurar un centrifugado feliz en los comentarios de abajo. Que la fuerza te acompañe!
- Eppendorf. Seguridad en las centrífugas.
- Eppendorf. Conductividad térmica.
- Sigma. Sample Temperature during High Throughput Ambient Temperature Centrifugation using Sigma 4-5L .
- Owen Mitch Griffith. Re-mezcla de muestras durante las separaciones en gradiente de densidad con el rotor de ángulo fijo Thermo Scientific Fiberlite F21-8x50y mL.
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