Observación
Las formas de las células bacterianas representan miles de millones de años de refinamiento evolutivo. Su pequeño tamaño se traduce en una elevada relación superficie-volumen, ideal para el transporte de nutrientes, la respiración eficiente y el mantenimiento de la integridad estructural. Se sabe que la forma general de la célula se rige por una gran cantidad de procesos celulares y señales ambientales (1-3). Sin embargo, rápidamente se convierte en un reto determinar cómo las variaciones en la forma afectan a la función celular. Los datos a escala del genoma que describen las contribuciones genéticas a la morfología bacteriana son un paso adelante para abordar esta cuestión. Además, las redes de interacción resultantes representan múltiples redes biológicas vinculadas que surgen de diferentes fenotipos de forma. Aquí describimos una instantánea genómica de la morfología de Escherichia coli K-12 en la fase media exponencial utilizando la colección de deleciones de Keio (4). Además, caracterizamos las interacciones genéticas entre las deleciones que afectan a la forma y el genoma de E. coli utilizando la conjugación de alto rendimiento (5, 6).
La plataforma de formación de imágenes de alto contenido que hemos desarrollado está muy adaptada a la complicada tarea de la formación de imágenes bacterianas. Los tiempos de obtención de imágenes en placas de micropocillos de alta densidad (384 o 1.536 pocillos) pueden superar con creces el tiempo de duplicación de E. coli, que es de aproximadamente 20 minutos, lo que supone un reto temporal para la obtención de imágenes de bibliotecas genómicas dentro de una fase común de crecimiento. Además, la motilidad de las células bacterianas vivas presenta dificultades adicionales a la hora de limitar la movilidad de las células durante la obtención de imágenes microscópicas. Para contrarrestar estos problemas, utilizamos un fijador de glutaraldehído, un primer paso habitual en las preparaciones de microscopía electrónica y conocido por preservar la forma de las células con impactos insignificantes en la resolución de la microscopía óptica (7). A continuación, las células se tiñeron negativamente en placas de imagen con fondo de cristal (de 0,17 mm de grosor) utilizando nigrosina y se fijaron suavemente mediante calor con control de humedad, llevando todas las células a un plano focal común. Esto evitó la necesidad de utilizar el contraste de fase, que era inviable debido a que el cono de luz del anillo de fase quedaba bloqueado por los bordes de los pozos en las microplacas de 384 pozos y de mayor densidad. El uso de un campo brillante permitió que pasara más luz a través de la muestra, lo que dio como resultado una exposición más rápida y una mejor precisión focal. Las placas preparadas de este modo pueden reimaginarse indefinidamente, y la calidad de la imagen no se degrada con el tiempo, lo que facilita la obtención de imágenes de alto contenido de muestras que han sido fijadas en una fase de crecimiento específica. Las imágenes resultantes muestran un intenso contraste entre las células y el fondo, lo que es muy deseable para la obtención de imágenes cuantitativas (Fig. 1; detallado en el Texto S1 y la Fig. S1 del material suplementario). Se cuantificaron diez características morfológicas por knockout: área, perímetro, eje de elipse mínimo, longitud de Feret mínima, eje de elipse mayor, longitud de Feret mayor, circularidad, redondez, relación de aspecto y solidez. A continuación, utilizamos el análisis de componentes principales (PCA) como análisis multiparamétrico y medio de reducción de la dimensionalidad (Fig. 1; Fig. S1). Esto nos dio un medio completamente insesgado de clasificación fenotípica después de la adquisición. Los tratamientos de forma anormal se revelaron ajustando un elipsoide alrededor del grupo de datos que representan la morfología de tipo salvaje en el espacio de componentes principales y seleccionando los que caen fuera de esta zona de corte. Los límites x, y, y z del elipsoide en cada dimensión corresponden a un corte de 3 desviaciones estándar en los tres primeros componentes principales.
TEXTO S1
Copyright © 2017 French et al.
Este contenido se distribuye bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution 4.0 International.
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Pantalla de forma celular de alto rendimiento de la colección de deleción de genes no esenciales de E. coli (Keio). Las micrografías mostradas fueron capturadas en una modificación de alto rendimiento de los métodos microscópicos descritos por Czarny et al. (25). Los paneles superiores representan ejemplos de fenotipos morfológicos observados en genes de la colección Keio: células de E. coli K-12 BW25113 de tipo salvaje, células largas y encadenadas de ΔtatA, células muy largas de ΔholD, células largas y ocasionalmente encadenadas de ΔpdxH, células redondas de ΔrodZ y células largas de ΔenvC. Un conjunto de datos anotados se proporciona en la Tabla S1, donde los éxitos individuales de genes pueden ser mejor visualizados. El gráfico de barras muestra el análisis de componentes principales de las características del análisis de imágenes y revela que la mayor parte de la varianza se explica por tres componentes principales. Cuando se representan en tres dimensiones, estos componentes principales pueden ajustarse a un elipsoide que rodea un origen que describe la variación de las morfologías celulares. El elipsoide está delimitado por distancias desde el origen que son 3 desviaciones estándar en cada dimensión del componente principal, respectivamente, desde el origen que describe las células de tipo salvaje. Las mutaciones que alteran la forma se definen aquí como aquellas que tienen coordenadas de componentes principales fuera del elipsoide.
De esta manera, identificamos unos 111 mutantes de deleción con defectos de forma (véase la Tabla S1 y el Conjunto de Datos S1 en el material suplementario). Nuestro enfoque fue validado con la confirmación de varios mutantes de forma conocidos, incluyendo el mutante de deleción tatA, que previamente se demostró que era largo y encadenado debido a la localización inadecuada de las amidasas en el periplasma (8). Se sabe que las mutaciones en holD, que codifica la subunidad ψ de la ADN polimerasa, causan morfologías filamentosas en E. coli (9). De hecho, la replicación del ADN tiene una relación sincrónica con los procesos de división celular (10, 11), y las alteraciones en la ADN girasa dan lugar a células alargadas con cromosomas únicos y sin septos (12). Curiosamente, la piridoxina 5′-fosfato oxidasa, codificada por pdxH, genera piridoxal 5′-fosfato (PLP) y provocó un cambio hacia células largas y ocasionalmente encadenadas. El PLP es un cofactor clave en el suministro de d-alanina y d-glutamato para la síntesis de peptidoglicano de la pared celular (13), y se sabe que los mutantes de pdxH tienen un fenotipo filamentoso (14). Del mismo modo, EnvC es un activador de las enzimas de remodelación de la pared celular y se sabe que causa un crecimiento filamentoso (15), y RodZ está implicado en la formación de paredes laterales y se sabe que causa una morfología esférica (16). Todos estos fenotipos se confirmaron en nuestro cribado. Sorprendentemente, 52 genes de nuestra lista codifican proteínas no caracterizadas en E. coli, siendo muchas de ellas proteínas putativas de la membrana externa o citoplasmática (Tabla S1). Así, la plataforma de cribado de alto contenido descrita identificó genes no esenciales implicados en el mantenimiento de la forma. Para caracterizar y sondear aún más los procesos biológicos que interactúan con estas mutaciones, optamos por preparar una matriz de interacción genética con un enfoque en estos genes de forma.
TABLA S1
Copyright © 2017 French et al.
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En total, se eligieron 60 deleciones correspondientes a los defectos de forma más fuertes como genes de consulta en un array genético sintético, 7 de los cuales no se conjugaron bien utilizando la metodología de Côté et al. (17). Esto dio lugar a que 53 genes de forma de interés de la Tabla S1 se cruzaran sistemáticamente (5, 6) con la colección Keio, generando 1,7 × 107 mutantes de doble deleción (véase el conjunto de datos S2 en el material suplementario) y una red sintética de interacción letal (véase la Fig. S3 en el material suplementario). Observamos que los mutantes con variaciones de forma más extremas (por ejemplo, los mutantes pdxH, rodZ, envC y gpmM) no se aparearon correctamente en condiciones convencionales y requirieron un apareamiento a temperatura ambiente durante un largo periodo de tiempo. Cuando los genes subyacentes a las interacciones letales sintéticas se enriquecieron utilizando términos de la Ontología Genética (GO) para procesos biológicos, los procesos de transporte y de oxidación-reducción estaban sobrerrepresentados (Fig. 2; Fig. S3). Esto se basó en un histograma de frecuencia de ocurrencia para cada término GO, con ontologías a las que se accedió utilizando el software EcoCyc (18) pathway-tools (19). Curiosamente, el canal de la membrana externa TolC está presente con alta frecuencia, lo que implica una relación entre la eficacia del sistema de eflujo de fármacos (Acr, Mdt, Ent, Emr y Mac) y la forma de la célula. El simportador predicho YdjN, que aparece con mayor frecuencia, está además implicado en el transporte de l-cisteína y en la respuesta al estrés oxidativo (20), procesos biológicos coincidentemente enriquecidos en la Fig. 2. De hecho, los genes implicados en procesos redox estaban a menudo vinculados a la respiración, como en los casos de ytfG, napG, cydB, nrdD y nrdG. Esto es particularmente curioso dado que la forma/curvatura de la membrana juega un papel en la función de la proteína asociada a la membrana (21, 22), especialmente teniendo en cuenta las posibles relaciones entre la eficacia de los fármacos y la respiración celular (23, 24). Sin embargo, existe un conocimiento limitado de la relación entre la forma (o la superficie) de la célula y la respiración. Asistimos a una notable preponderancia de las interacciones de los genes de la forma con los implicados en las funciones respiratorias. Por ejemplo, en el trabajo de Côté et al. (17), se cruzaron 82 genes de estrés por nutrientes con la colección de Keio y se obtuvieron menos de 200 interacciones letales sintéticas con genes implicados en procesos redox, mientras que, por el contrario, se observaron unas 800 interacciones de este tipo para 53 genes perturbadores de la forma (Fig. 2).
Conjunto de datos S2
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Análisis a escala del genoma de los genes de E. coli que interactúan con los genes que alteran la forma. El panel izquierdo muestra un mapa de calor para las interacciones letales sintéticas y un histograma de frecuencia de ocurrencia para los procesos biológicos, organizados por términos GO. Las interacciones letales sintéticas se identificaron utilizando el método de Côté et al. (17), con anotaciones identificadas utilizando el software EcoCyc pathway-tools (19). (Los términos GO se generaron a partir de nuestros 1.373 genes letales sintéticos, y muchos genes tienen múltiples términos de procesos biológicos correspondientes). Los procesos de transporte, redox y metabólicos mostraron un fuerte enriquecimiento y están resaltados con estrellas rojas. Cada uno de estos procesos se detalla en los paneles de la derecha, destacando las interacciones letales sintéticas más frecuentes y sus correspondientes productos génicos. Curiosamente, muchos genes de transporte están estrechamente relacionados con la respiración y el transporte de protones, como cydD, putP y trkG. En general, esto demuestra un intrincado vínculo entre la forma de la célula, el transporte y los procesos de oxidación-reducción en E. coli.
La búsqueda de deleciones genéticas en la colección de Keio, que dan lugar a defectos de forma, dio como resultado una gran cantidad de genes no caracterizados. La conexión de estos genes con las funciones en la forma de la célula puede ayudar en la clasificación funcional posterior, especialmente cuando se perfilan simultáneamente sus interacciones genéticas. En general, los genes implicados en el mantenimiento de la forma parecen estar intrínsecamente ligados a procesos biológicos como el transporte y la oxidación y reducción, pero es necesario seguir trabajando para aclarar la naturaleza de las interacciones observadas. Resulta especialmente interesante saber si las perturbaciones físicas, como la geometría de empaquetamiento o las variaciones de curvatura (21), acompañan a los defectos de forma. No obstante, la investigación presentada aquí amplía nuestra comprensión de la complicada biología que define la forma bacteriana. Además, la plataforma de microscopía de alto contenido descrita aquí es altamente modificable para cualquier biblioteca bacteriana genómica o química.