Fuente de la muestra humana
Un total de 133 embriones humanos en estadio 2PN utilizados en el presente estudio se obtuvieron del Biobanco RENEW de la Universidad de Stanford, con el consentimiento informado por escrito de que eran donados para la investigación no troncal. Todos los embriones se congelaron en la fase cigótica o 2PN, y es muy probable que estos embriones representen la población típica de FIV, ya que no fueron seleccionados antes de la criopreservación. La desidentificación se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo «The RENEW Biobank», que fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Stanford. No se asoció a los embriones ninguna información sanitaria protegida. De los 133 embriones descongelados, 91 parecían vivos después de la descongelación, y el resto fueron excluidos porque eran visiblemente no viables (antes de cualquier aspiración con micropipeta). Otros dos embriones fueron excluidos de nuestros datos porque estaban estructuralmente dañados durante la aspiración de la micropipeta y debido a la ruptura de la ZP, dejándonos con un total de 89 embriones humanos en nuestro conjunto de datos. Estos 89 embriones humanos se descongelaron y se midieron en grupos más pequeños en el transcurso de seis experimentos distintos.
Cultivo de embriones humanos
Los embriones humanos se descongelaron utilizando un kit de descongelación Quinn’s Advantage (CooperSurgical) como se ha descrito anteriormente26,27. En resumen, los crioviales o pajuelas se sacaron del tanque de nitrógeno líquido y se expusieron al aire antes de colocarlos en un baño de agua a 37°C. Una vez descongelados, los embriones se incubaron en medio de descongelación de sacarosa 0,5 y 0,2 M a 37 °C durante 10 minutos cada uno. A continuación, los embriones se lavaron en una solución diluyente de descongelación a 37 °C y se cultivaron durante 3-4 horas en el medio de escisión de ventaja de Quinn (CooperSurgical) complementado con un 10% de sustituto de proteínas de suero (CooperSurgical). En algunos experimentos, se monitorizó el desarrollo de los embriones mediante el sistema Eeva (Auxogyn).
Recogida de embriones y ovocitos de ratón y FIV
Los ratones F1 de la cepa híbrida (C57B6xDBA2) (hembras de 4-6 semanas de edad) se adquirieron en el Jackson Laboratory y se mantuvieron en la instalación de animales del Lorry Lokey Stem Cell Research Building. Todos los experimentos se realizaron bajo el protocolo #16146 del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales, que fue aprobado por el Panel Administrativo de Cuidado de Animales de Laboratorio de la Universidad de Stanford. Brevemente, los ratones hembra fueron superovulados por inyección intraperitoneal de 10IU de gonadotrofina de suero de yegua preñada (PMSG, Sigma) 10IU de gonadotrofina coriónica humana (hCG, Sigma). Tras aparear a una hembra con un macho de 8-10 semanas de la misma cepa, se recogieron los complejos cúmulo-ovocito de los oviductos en medio M2 (Millipore) y se eliminaron las células del cúmulo en hialuronidasa (Sigma) y se lavaron en medio M2. Después de las mediciones mecánicas, los embriones se cultivaron en el medio de escisión de ventaja de Quinn (CooperSurgical) con un 10% de sustituto de proteína de suero (CooperSurgical). Para medir el efecto de la maduración de los ovocitos en la mecánica, se recogieron ovocitos en distintas fases de maduración. Los ovocitos GV se recogieron 48 h después de la inyección de PMSG. Aproximadamente 48 h después de la inyección de PMSG, se inyectó hCG. Los ovocitos MI se recogieron 5-6 h después de la inyección de hCG, y los ovocitos MII se recogieron 18-20 h después de la inyección de hCG.
Los embriones se excluyeron de nuestros datos si mostraban una morfología muy pobre, si procedían de ratones que produjeron menos de 10 embriones o si se encontraban en un grupo en el que menos del 40% de los embriones mostraron la formación del pronúcleo tras la FIV. Si los ratones producían muy pocos embriones o las tasas de fecundación eran demasiado bajas, considerábamos que algunas partes del protocolo experimental (inyección de hormonas, medios de comunicación, etc.) debían haber afectado negativamente a los embriones y, por tanto, podían no ser representativos de los embriones normales de ratón. Para clasificar los embriones en grupos de control y de medición, se separaron al azar mientras se observaban con un aumento lo suficientemente bajo como para que la morfología fuera difícil de distinguir. Sólo se mantuvieron unos pocos embriones como controles negativos en cada experimento, sumando un total de 35 en todos los experimentos (Fig. Suplementaria 5). El tamaño de las muestras para los experimentos con animales se determinó en parte por la cantidad de datos necesarios para alcanzar la significación estadística, y en parte por el tamaño de las muestras visto en publicaciones con investigaciones similares. Los datos mecánicos y de formación de blastocistos de los 282 embriones de ratón que medimos (Fig. Suplementaria 4 y Fig. Suplementaria 5) se recogieron en el transcurso de 15 experimentos distintos.
Microinyección de ovocitos de ratón y FIV
En este experimento se utilizó una cepa de ratón CBA del Jackson Laboratory. Tras la superovulación inducida de ratones hembra de 4-6 semanas de edad, se recogieron los ovocitos detenidos en metafase-II y se extrajeron las células del cúmulo. A continuación, se microinyectaron oocitos con ∼10 pl de anticuerpo monoclonal 18A10 (abCam) a una concentración de 1 mg ml-1. Algunos ovocitos se mantuvieron como controles negativos y se sometieron a una inyección simulada con agua o a ninguna inyección. Los ovocitos se cultivaron durante una hora antes de la FIV convencional. Se recogieron espermatozoides de machos CBA de 8-10 semanas de edad (Jackson Laboratory) y se dejaron capacitar en medio HTF (CooperSurgical) durante 45 minutos antes de la inseminación. Se añadió una cantidad adecuada de la suspensión de esperma a la gota de medio donde se cultivaron los ovocitos. No se excluyó ninguna muestra de este experimento, y los ovocitos se clasificaron en grupos de control frente a grupos medidos sin tener en cuenta la morfología y en un orden aleatorio.
Medición de las propiedades mecánicas de los embriones
Se utilizó un sistema automatizado de aspiración con micropipeta para medir los embriones, y un microscopio de luz construido a medida para grabar el vídeo de la aspiración. El microscopio de luz se construyó con piezas de Thorlabs, y utiliza un objetivo Olympus × 20 de 0,4 de apertura numérica y una iluminación de diodos emisores de luz blanca. Para realizar una medición, se coloca cada embrión en su propia gota de medio y se baja la micropipeta en la gota. El embrión se manipula con la pipeta de manera que el cuerpo polar esté orientado hacia el exterior de la abertura de la pipeta. No controlar la posición de medición podría confundir nuestros resultados, ya que hay un espacio entre el oolema y la ZP cerca del cuerpo polar, mientras que este espacio perivitelino es mucho más pequeño alrededor del resto del embrión. Los estudios también han demostrado que la tensión cortical del ovocito está polarizada con respecto al huso meiótico66; por lo tanto, tuvimos cuidado de medir el extremo del embrión opuesto al cuerpo polar, que suele estar cerca del huso.
Las micropipetas para medir embriones de ratón tenían 40-μm de diámetro interior (Origio MBB-FP-L-15); las de los embriones humanos tenían 70-μ de diámetro interior y fueron hechas a medida por Origio. Se aplica una presión de mantenimiento de -0,03 p.s.i. para sujetar el embrión y sellar la apertura de la pipeta. A continuación, se aplica una presión escalonada de -0,345 p.s.i. al embrión. La presión deseada se aplica mediante un sistema de control PID de bucle cerrado. Un actuador lineal (Firgelli L12) mueve el tapón de una jeringa de 1 ml y un sensor (Honeywell SSCSNBN010NDAA5) mide la presión. Estos sensores están conectados a un ordenador mediante un microcontrolador Arduino Uno, que puede transmitir las lecturas de los sensores y dar órdenes al actuador en tiempo real. Se graba un vídeo de la aspiración a 75 f.p.s. utilizando una cámara CMOS (Thorlabs DCC1545M). Todo el hardware se controla mediante el software Labview (National Instruments) hecho a medida. Se utilizó un programa automatizado de Matlab (Mathworks) hecho a medida para extraer la profundidad de aspiración del embrión y ajustarla a un modelo mecánico. Se utilizó la detección de bordes y el umbral para identificar la esquina y la apertura de la pipeta. Se utilizó la coincidencia de plantillas basada en la correlación cruzada para rastrear automáticamente el borde del embrión a lo largo del tiempo y eliminar el sesgo de las mediciones manuales. Durante la medición de los parámetros mecánicos del embrión, el investigador estaba ciego en cuanto a si habían sobrevivido hasta la fase de blastocisto o no, o a qué grupo pertenecían (en el caso de los experimentos de microinyección).
Modelo mecánico de embriones unicelulares
Se utilizó un modelo sólido elástico lineal modificado (modelo de Zener modificado) para representar el embrión mientras era aspirado en la micropipeta. Asumiendo una entrada escalonada para la fuerza aplicada al embrión, la ecuación para la profundidad de aspiración en el tiempo es:
Donde
Se eligió el modelo de Zener modificado en lugar de otros modelos viscoelásticos comúnmente utilizados como el de Maxwell, Kelvin-Voigt y Zener (Standard Linear Solid) basándonos en la inspección visual de la dinámica de respuesta. Observamos en nuestros experimentos que la respuesta de un embrión a una entrada de presión escalonada era una elongación instantánea seguida de un componente de decaimiento exponencial (invertido para que la deformación aumentara con el tiempo), seguido finalmente de una deformación a una tasa constante como se muestra en la Fig. 2c.
Un cuerpo de Maxwell consiste en un resorte y un amortiguador en serie; por lo tanto, su respuesta a una presión escalonada es una elongación instantánea seguida de una deformación lineal constante. Como nuestros datos mostraban un claro componente exponencial, este modelo se consideró insuficiente para describir nuestro sistema. Un cuerpo Kelvin-Voigt está formado por un muelle y un amortiguador en paralelo; por tanto, su respuesta a una presión escalonada es una exponencial decreciente en la que la profundidad de aspiración se asienta en una profundidad máxima final. Este modelo no capta la elongación instantánea que experimenta el embrión ni la tasa de deformación lineal después de que el componente exponencial se asiente. El modelo de Zener añade un muelle adicional en paralelo al cuerpo de Maxwell y su respuesta a la presión es similar a la de un cuerpo de Kelvin-Voigt, pero con una elongación instantánea cuando se aplica la presión por primera vez. Aun así, este modelo requirió la adición de un amortiguador extra en serie con los otros tres componentes para capturar con precisión la deformación lineal experimentada por el embrión después de que el componente exponencial se asentara.
En la Fig. Suplementaria 10 se muestra una comparación del error de ajuste para cinco modelos diferentes. Nuestro modelo (que tiene 4 parámetros) parece apropiado porque su error es casi tan bajo como el error del modelo de cinco parámetros, con o sin el parámetro extra innecesario. Por lo tanto, creemos que nuestro modelo describe con precisión los datos sin exceso de ajuste.
Evaluación de la viabilidad del embrión y de los parámetros del ciclo celular
La formación de blastocitos se utilizó como un proxy de la viabilidad al construir un clasificador para distinguir entre embriones viables y no viables basado en la mecánica. Este clasificador fue validado en ratones, como se muestra en los experimentos de nacimientos vivos de la Fig. 2. Después de medir los parámetros mecánicos del embrión en el día 1, los embriones se cultivaron durante 5-6 días dentro del sistema Auxogyn Eeva, con fotogramas capturados cada 5 minutos. Los parámetros del ciclo celular27 se extrajeron de los vídeos resultantes, y los embriones que formaban blastocistos en el día 5 (ratón) o en el día 6 (humano) se clasificaron como viables.
Predicción de la viabilidad de los embriones
La supervivencia de los blastocistos se utilizó como información de base para entrenar un clasificador para predecir la viabilidad de los embriones basándose en las mediciones mecánicas del día 1. Se entrenó un clasificador SVM binario con un núcleo RBF sobre los parámetros mecánicos del embrión. Los valores óptimos de la restricción de caja (c) y de la sigma RBF (σ) se eligieron mediante una validación cruzada de 10 veces. Una vez que se determinaron los parámetros óptimos de la SVM, se realizaron 100 simulaciones Monte Carlo de validación cruzada de 10 veces para calcular el área media bajo la curva ROC y la curva PR.
Debido a que se midieron un total de cuatro parámetros mecánicos para cada embrión, se llevó a cabo una selección de características hacia adelante para determinar el número óptimo de parámetros a incluir en nuestro clasificador de viabilidad. Los resultados de este proceso se muestran en la Fig. Suplementaria 2C, demostrando que hay una gran mejora cuando se utilizan dos parámetros en lugar de uno, y una ligera mejora cuando se añade un tercer parámetro. El uso de los cuatro parámetros reduce la eficacia de nuestro clasificador porque el cuarto parámetro no es útil para separar los embriones por viabilidad, sino que añade una dimensión extra a los datos.
Para llevar a cabo la selección de características hacia delante, primero se utilizó cada parámetro por sí solo para separar los embriones y se encontró un clasificador óptimo. Como se ha descrito anteriormente, se realizó una validación cruzada de 10 veces para estimar el área bajo la curva ROC para ese parámetro. Una vez elegido el parámetro con mayor valor predictivo, se entrenó y optimizó un nuevo clasificador utilizando cada uno de los parámetros restantes. El parámetro que causaba la mayor mejora en el valor predictivo se añadía al clasificador, y el proceso se repetía hasta que no quedaban parámetros.
Para los experimentos sobre la liberación de gránulos corticales, las cifras se mostraban utilizando sólo el parámetro más predictivo de la viabilidad (rigidez, k1) por simplicidad. Se utilizó el clasificador de tres parámetros previamente entrenado para clasificar los embriones según su viabilidad, pero determinamos que las cifras eran más claras cuando se utilizaba únicamente la rigidez.
Experimentos con ratones nacidos vivos
Los ratones hembra CD1 se compraron en el Laboratorio Jackson y se aparearon con machos vasectomizados para que sirvieran de receptores pseudoembarazados. Los ratones se mantuvieron en las mismas condiciones que los utilizados para la recogida de embriones. Se midieron los parámetros mecánicos de los embriones recogidos de ratones (C57B6xDBA2) F1 y los embriones se clasificaron en grupos viables o no viables en función de estos parámetros. En cada experimento, se transfirió un número igual de embriones de ratón en fase unicelular (entre 10 y 15) al oviducto de una receptora de embriones recién tapada. Este experimento se repitió cuatro veces (Tabla Suplementaria 1) con 10-15 embriones transferidos a cada ratón en cada experimento. El técnico que transfería los embriones no sabía qué embriones pertenecían a cada grupo. El mismo número de embriones en la misma fase de desarrollo se eligió al azar y se transfirió a ratones pseudoembarazados como control. Las crías se esperaban el día 20 después de la operación. Se realizó una prueba χ2 para comprobar si la diferencia en el número de cachorros nacidos en cada grupo (viable, no viable o control) era estadísticamente significativa.
Preparación de la muestra de RNA-seq
Se realizaron dos experimentos separados con un total de 32 embriones humanos 2PN para obtener muestras para RNA-seq. Se dejó que los embriones se recuperaran durante 3-4 h en medios de cultivo tras la descongelación y se midieron los parámetros mecánicos. Cada embrión se clasificó como viable o no viable en función de sus parámetros mecánicos. El ADNc de cada embrión se sintetizó a partir del ARN total utilizando el kit SMARTer Ultra Low RNA (Clontech) según el protocolo del proveedor. Tras el cizallamiento Covaris del ADNc de longitud completa, se generaron bibliotecas finales utilizando el NEBNext DNA Sample Prep Master Mix (New England Biolabs) y se sometieron a un control de calidad con un bioanalizador Agilent 2100. Las muestras resultantes se sometieron a la secuenciación de ARN unicelular en una plataforma Illumina HiSeq 2000 utilizando la estrategia de secuenciación de 100 pb por pares.
De los 25 embriones elegidos para la secuenciación, tres embriones fueron excluidos debido a dificultades técnicas (no se recuperó ARN). Presentamos un total de 22 embriones para la secuenciación, que se clasificaron como viables o no viables en función de los parámetros mecánicos.
Procesamiento de datos de ARN-seq
La secuenciación devolvió ∼1.000 millones de lecturas paired-end de longitud 101 pertenecientes a 22 embriones en total. Los datos de las secuencias en bruto en formato fastq se sometieron a un control de calidad para eliminar las llamadas de bases de baja calidad y las secuencias adaptadoras (FastX trimmer y clipper). Las secuencias filtradas se alinearon con el genoma humano de referencia (hg18) con la herramienta de alineación STAR67 en un ordenador. Los archivos .bam resultantes se filtraron para comprobar la calidad de la alineación, se clasificaron y se eliminaron los duplicados de la PCR (SAMtools sort y rmdup). A continuación, se calcularon los recuentos por gen utilizando HTSeq-count68 y comparando las lecturas alineadas con el transcriptoma humano de referencia.
Para tener en cuenta los posibles efectos de lote derivados de la variación biológica entre los pacientes, los diferentes protocolos de congelación, los medios de cultivo u otros factores, tuvimos que determinar qué embriones procedían de qué pacientes. Analizamos las variantes de secuencia en los transcriptomas de cada embrión y realizamos una agrupación jerárquica de las variantes para las que teníamos una buena cobertura de secuenciación (Fig. 11 suplementaria). Determinamos que de los 22 embriones secuenciados, 17 tenían embriones «hermanos», mientras que 5 eran los únicos embriones de sus respectivas pacientes. Excluimos esos cinco, y luego utilizamos la función ComBat en el paquete sva69,70 en R para eliminar los efectos de lote de los datos de RNA-seq de los 17 embriones restantes. Aunque la exclusión de los cinco embriones sin hermanos puede haber sesgado nuestros resultados, habría sido imposible estimar la variación biológica dentro de esos pacientes utilizando sólo una muestra y, por lo tanto, tuvimos que excluirlos. Una vez eliminados estos efectos de lote, nuestros datos reflejaron diferencias en los transcritos heredados por la madre entre embriones viables y no viables, consistentes en todos los pacientes. Se realizó un análisis de expresión diferencial en los datos ajustados utilizando el paquete R edgeR28. Los genes con valores q (valores P ajustados por el método de Benjamini-Hochberg) inferiores a 0,01 se clasificaron como estadísticamente significativos.
Análisis de ontología y redes de genes
La lista de genes DE con valores q<0,01 se pasó a la herramienta DAVID (NCBI), y se realizó un clustering con términos de ontología relacionados con BPs y funciones moleculares (MFs). Los grupos con al menos un término con un valor P ajustado<0,05 se consideraron estadísticamente significativos y se incluyeron en la Tabla 1. Los términos dentro de cada clúster se combinaron en una sola frase descriptiva y se incluyeron en la Tabla 1. Se llevó a cabo un análisis adicional de ontología de genes con los paquetes goseq y GO.db en R. Todas las categorías de ontología de genes con al menos 10 genes se clasificaron en orden del porcentaje de genes DE dentro de esa categoría, y se compararon con la proporción de genes DE en todas las categorías.
Se utilizó IPA para analizar la lista de genes DE junto con el cambio log-fold entre embriones viables y no viables. Se llevó a cabo un análisis central para encontrar los procesos celulares que se predijo que estaban significativamente aumentados o disminuidos en base a los cambios de expresión génica, así como las redes de genes que estaban regulados como grupo.
Tinción de gránulos corticales
Los parámetros mecánicos de los embriones de ratones B6 y los embriones de FIV (de ratones CBA) se midieron en la etapa de cigoto en dos experimentos separados. Los embriones se clasificaron como viables o no viables en función de sus parámetros mecánicos, y luego se eliminó la ZP exponiendo brevemente los embriones a la solución de Tyrode (Sigma), seguida de tres lavados en PBS (Invitrogen). A continuación, los embriones desnudos se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente y se tiñeron con un anticuerpo de lectina marcado con isotiocianato de fluoresceína (Sigma) y con 4,6-diamidino-2-fenilindol. Se utilizó un microscopio confocal de barrido láser Zeiss LSM510 para la visualización y captura de imágenes.
Procesamiento de imágenes confocales
Las pilas de imágenes crudas se convirtieron a formato TIFF y se escribieron scripts de Matlab personalizados para extraer los parámetros de la imagen. Se realizó un ajuste de contraste en todas las imágenes de cada pila para tener en cuenta la pérdida de señal a mayores profundidades de imagen, y se calculó una imagen de proyección para cada pila. El citoplasma de cada célula se aisló realizando un umbral automático mediante el método de Otsu, la detección de bordes de Canny y una transformada de Hough circular para detectar la ubicación y el tamaño de cada célula. Se calculó un perfil de intensidad a lo largo de una trayectoria alrededor de la circunferencia de cada célula, al 95% del radio de la misma, y con una anchura del 10% del radio de la célula. Los parámetros representados en la imagen 4 eran (a) la media y (b) la d.s. de este perfil de intensidad. El investigador no conocía los parámetros mecánicos de cada embrión ni el grupo (en el caso de los experimentos de microinyección) mientras medía los parámetros de los gránulos corticales.
Pruebas estadísticas
Se utilizó una prueba de χ2 para comprobar si la proporción de embriones que resultaron nacidos vivos (sección 2.2) era significativamente diferente entre los tres grupos experimentales (predicción de viabilidad basada en la mecánica, predicción de no viabilidad basada en la mecánica y control-ordenado sólo por la morfología). La única suposición que hace esta prueba es que ningún grupo (un «grupo» se refiere a embriones que dan lugar a nacimientos vivos o a embriones que no dan lugar a nacimientos vivos) contiene menos de cinco muestras. Esta suposición se cumple para ambas comparaciones que se realizaron (viable frente a control, viable frente a no viable).
Para determinar los genes con diferencias significativas en la expresión entre embriones humanos viables y no viables, se utilizaron los paquetes sva y edgeR en R. Estos paquetes han sido bien validados para su uso en la eliminación de los efectos de lote y la determinación de las diferencias significativas en la expresión para los datos de ARN-seq.
Se utilizó una prueba de suma de rangos de Wilcoxon para comparar el brillo de los gránulos corticales entre los embriones (no se utilizó una prueba t porque las muestras tenían un número bajo y no estaban distribuidas normalmente según la prueba de Lilliefors). Para determinar si la inyección del anticuerpo IP3 cambiaba la rigidez media del embrión, se utilizó una prueba t de dos caras porque se determinó que los grupos inyectados con anticuerpos y los inyectados con controles tenían una distribución normal mediante la prueba de Lilliefors. Se utilizó una prueba de Kolmogorov-Smirnov de dos muestras para demostrar que la inyección del anticuerpo provocaba un cambio significativo en la distribución de los valores de rigidez. Se utilizaron pruebas de suma de rangos de Wilcoxon para comparar las diferencias entre los cuartiles de los grupos inyectados con anticuerpos y los inyectados con controles, ya que había muy pocas muestras en cada cuartil. También se utilizaron pruebas de suma de rangos de Wilcoxon para probar la diferencia en los valores medianos de la rigidez de los ovocitos entre las etapas GV, MI y MII porque los valores de rigidez no cumplían los criterios de normalidad.