Mortalidad y disbiosis en diferentes regiones del intestino durante la ontogenia
La mortalidad de las avestruces juveniles se produjo a lo largo de todo el período de estudio de 12 semanas, pero fue mayor entre las 4 y 8 semanas de edad, con un pico a las 6 semanas (Fig. 1b). Los individuos con la enfermedad siguieron la curva de crecimiento de todos los demás individuos antes de caer rápidamente en peso antes de la muerte (Fig. 1c, d). Se desconoce la causa de la reducción de peso, pero se observó que los individuos enfermos dejaron de comer y beber, y en algunos casos sufrieron diarrea, por lo que la deshidratación y el desgaste son explicaciones probables. En total, el 40% de los pollos murieron por sospecha de enfermedad (68/170, excluyendo 60 controles y 4 individuos heridos). Las autopsias de los individuos enfermos y de los controles revelaron que la mortalidad estaba asociada a una extensa inflamación del tracto gastrointestinal (Fig. 1e; Figura S1). Las puntuaciones de inflamación intestinal de los individuos enfermos (media ± SD para el íleon = 3,1 ± 1,0, ciego = 2,0 ± 1,3, colon = 2,0 ± 1,2) eran sustancialmente más altas que las de los individuos de control (íleon = 0,4 ± 1,0, ciego = 0.04 ± 0,29, colon = 0,08 ± 0,45) (Figura S1).
Patrones de mortalidad de avestruces hasta las 12 semanas de edad. a Uno de los polluelos de avestruz incluidos en el estudio con 1 semana de edad. b La mortalidad acumulada y la tasa de mortalidad por semana. c, d Los pesos transformados logarítmicamente a lo largo del tiempo de los individuos de control que fueron seleccionados aleatoriamente para la eutanasia en las semanas 2, 4, 6, 8, 10 y 12 (líneas azules en c), y los individuos que murieron por sospecha de enfermedad (líneas rojas en d). Las líneas grises ilustran los pesos de todos los demás individuos que sobrevivieron durante todo el período. e Fotografías durante la disección que ilustran la inflamación intestinal generalizada en un individuo enfermo (abajo) en comparación con un individuo de control (arriba)
La estructura de la microbiota de los individuos enfermos y de control era extremadamente diferente en las tres regiones intestinales (Fig. 2, Figura S2, Tabla 1). En concreto, hubo diferencias significativas en las distancias de la comunidad microbiana (obtenidas tanto con las medidas de Bray-Curtis (BC) como con las de UniFrac ponderado (wUF)) entre los individuos enfermos y los de control, controlando la edad, el sexo, el grupo y el tiempo transcurrido desde la muerte (Tabla 1). Sin embargo, las medidas de Bray-Curtis y UniFrac ponderado revelaron patrones contrastados: Las distancias de Bray-Curtis fueron mayores en el íleon, disminuyendo hacia el intestino inferior (ciego-colon), mientras que las medidas de UniFrac ponderadas fueron mayores en el colon, disminuyendo hacia el íleon (Tabla 1). El sexo, el grupo y el tiempo transcurrido desde la muerte no tuvieron efectos significativos en ninguna de las medidas de distancia del microbioma en ninguna de las regiones del intestino (Tabla 1).
Participaciones del análisis de coordenadas principales (PCoA) de las disimilitudes de Bray-Curtis entre los microbiomas de los individuos de control (azul) y los individuos enfermos (rojo). Las elipses indican intervalos de confianza del 90%
También se encontraron grandes diferencias al examinar la variación de los microbiomas entre los individuos enfermos frente a la variación entre los individuos de control. Los individuos enfermos eran más similares entre sí en el microbioma ileal que los controles cuando se utilizaron las distancias de Bray-Curtis, pero no las de UniFrac ponderadas (BC Prueba de homogeneidad multivariante de la dispersión de grupos (betadisper): F1, 99 = 13,9, p = 0,0003. wUF betadisper: F1, 99 = 0,6, p = 0,46) (Figuras S3-S4). Por el contrario, lo contrario ocurrió en el ciego y el colon (BC cecum betadisper: F1, 105 = 0,08, p = 0,79. BC colon betadisper: F1, 106 = 1,3, p = 0,25. wUF cecum betadisper: F1, 105 = 11,2, p = 0,001. wUF colon betadisper: F1, 106 = 11,4, p = 0,001) (Figura S3). En conjunto, estos resultados muestran que la composición bacteriana de los individuos enfermos y de los controles fue la que más difirió en el íleon, pero que el colon contenía los grupos más filogenéticamente distintos.
Diversidad alfa y disbiosis específica de la edad en diferentes regiones intestinales
La diversidad microbiana alfa de los individuos enfermos se redujo en gran medida en las tres regiones intestinales en comparación con los controles (GLMs enfermedad: íleon F1, 99 = 56,7, p = 2,5e-11; ciego F1, 105 = 16,1, p = 0,0001; colon F1, 106 = 61,5, p = 3,9e-12), controlando la edad (Fig. 3). En el íleon, las diferencias persistieron en todas las edades (GLM enfermedad*edad: F1, 97 = 0,0001, p = 0,99), y hubo pocos efectos de la edad, incluso en individuos sanos (GLM edad: F1, 98 = 1,4, p = 0,23). En el ciego y el colon, los individuos enfermos presentaban una menor diversidad alfa que los controles a edades tempranas (Tabla 1; Fig. 3), pero estas diferencias disminuyeron con la edad, ya que la diversidad aumentó en general en todos los individuos (GLM enfermedad*edad: ciego F1, 103 = 10,2, p = 0,002; colon F1, 104 = 9,1, p = 0,003). Por tanto, las reducciones en la diversidad alfa asociadas a la enfermedad fueron evidentes en todo el intestino a edades tempranas, pero se restringieron al íleon a edades más avanzadas (véase también ).
Diversidad alfa (índice de Shannon) durante el desarrollo en el íleon, ciego y colon. Los individuos de control se muestran en azul y los individuos enfermos en rojo. Las líneas muestran las curvas de suavizado de regresión local ajustadas y las áreas sombreadas el intervalo de confianza del 95%. El panel inferior derecho muestra todos los valores de diversidad alfa juntos
Taxa asociada a la enfermedad en el íleon
Para entender mejor las disimilitudes microbianas entre los individuos enfermos y los de control, evaluamos la composición taxonómica de todas las regiones gastrointestinales. El íleon mostró la evidencia más llamativa de disbiosis (Fig. 4). Los individuos de control presentaban una comunidad diversa de diferentes clases bacterianas en el íleon, mientras que los individuos enfermos mostraban un florecimiento de Gammaproteobacterias y una importante reducción de Bacilos y otras clases más raras. Una investigación detallada de las familias pertenecientes a las Gammaproteobacterias mostró un dominio casi completo de Enterobacteriaceae en las muestras de íleon enfermo, mientras que los individuos de control albergaban un conjunto diverso de familias de Gammaproteobacterias (Figura S5).
La proporción de clases bacterianas por individuo y región intestinal, ordenada por edad (barras de la izquierda = más jóvenes, barras de la derecha = más viejos). Columna izquierda = individuos de control, columna derecha = individuos enfermos. Fila superior = íleon, fila central = ciego, fila inferior = colon
Las Enterobacteriaceae gramnegativas son una gran familia bien conocida por englobar varios patógenos y patobiontes intestinales, y se observan con frecuencia en mayor abundancia en huéspedes con disbiosis intestinal. Había 19 unidades taxonómicas operativas (OTUs; secuencias con un 100% de identidad nucleotídica) asociadas con Enterobacteriaceae en el íleon, y las búsquedas en la base de datos de nucleótidos del NCBI coincidieron con una amplia gama de géneros, incluyendo Escherichia, Klebsiella, Shigella, Salmonella, Yokenella, Citrobacter, Enterobacter, Cronobacter, Atlantibacter, Pluralibacter, Leclercia y Kluyvera. En estudios anteriores, se ha demostrado que varios miembros de la familia Enterobacteriaceae a menudo coocurren y florecen simultáneamente durante la disbiosis , lo que es coherente con nuestros resultados.
Otra característica clave de la disbiosis en el íleon fue que ciertos individuos tenían microbiomas compuestos casi en su totalidad por Clostridia, un patrón que no se observó en ningún individuo de control (Figura 4). Las familias de Clostridia mostraron otros patrones taxonómicos sorprendentes en los individuos enfermos, incluyendo un aumento importante de Peptostreptococcaceae y una marcada reducción de Ruminococcaceae y otras familias raras (Figura S5). La familia Peptostreptococcaceae estaba representada por seis OTUs en nuestros datos, y las búsquedas por ráfaga arrojaron coincidencias con varias especies de Paeniclostridium, Paraclostridium y Clostridium. La más prevalente de estas OTUs coincidió con Paeniclostridium sordellii, una bacteria conocida por tener cepas virulentas que causan una alta morbilidad y mortalidad a través de la enteritis y la enterotoxemia tanto en los seres humanos como en los animales.
A continuación, identificamos OTUs específicas asociadas con la disbiosis mediante la realización de pruebas binomiales negativas de Wald de las abundancias bacterianas, mientras se controla la edad de los anfitriones. Treinta y ocho OTUs estaban significativamente sobrerrepresentados en la ílea de los individuos enfermos (Fig. 5), de los cuales la mayoría pertenecían a Clostridia, incluyendo Ruminococcaceae, varios Clostridium spp, y Epulopiscium, pero también Bacteroides, Escherichia y Bilophila wadsworthia (Tabla S1).
Diferencialmente abundantes OTUs (q < 0.01) entre los individuos de control y los enfermos, por separado para las tres regiones del intestino. Los ejes y muestran las familias taxonómicas y los OTU se han coloreado a nivel de clase. Los cambios log2 positivos indican una mayor abundancia de OTUs en los individuos de control y los cambios log2 negativos indican una mayor abundancia en los individuos enfermos. NA = OTUs sin clasificación de familia
Taxa asociada a la enfermedad en el ciego y el colon
El examen de las abundancias relativas de las clases bacterianas en el ciego y el colon mostró que los individuos de control eran en gran medida similares, mostrando una composición del microbioma relativamente estable a través de los huéspedes y las edades. Sin embargo, se produjeron importantes alteraciones en la composición microbiana de ambas regiones intestinales en los individuos enfermos (Fig. 4). Al igual que en el íleon, las Gammaproteobacterias eran más prevalentes en el ciego y el colon de los individuos enfermos, pero una reducción de Clostridia y un aumento de Bacteroidia constituían las diferencias más destacadas. Otros análisis taxonómicos de Bacteroidia mostraron que la familia Porphyromonadaceae había proliferado en el ciego y el colon de los individuos enfermos (Figura S5). Esta familia abarcaba dos especies en nuestros datos, Parabacteroides distasonis y Dysgonomonas sp., que se encuentran habitualmente en la microbiota intestinal normal. Sin embargo, P. distasonis ha sido identificada previamente como una especie promotora de colitis en ratones y los miembros de Dysgonomonas son conocidos por estar asociados con la caquexia y la inflamación intestinal .
Las pruebas de abundancia diferencial identificaron grandes similitudes en los patrones de disbiosis del ciego y el colon, ya que 50 de los 56 (89%) OTUs que eran más abundantes en las muestras de colon enfermo también eran más abundantes en las muestras cecales enfermas (Fig. 5; Tablas S2-S3). Además, 15 de estas UOT (39%) también estaban significativamente sobrerrepresentadas en el íleon (Tabla S1). La UOT más significativa en el ciego (q = 1,2e-53) y el colon (q = 2,4e-56) estaba ausente en los individuos de control, pero era abundante en los individuos enfermos (Tablas S2-S3). Esta UOT, que también fue muy significativa en el íleon (q = 3,4e-21), tuvo una coincidencia del 100% con Clostridium paraputrificum, un conocido patógeno humano asociado a la sepsis y la enterocolitis necrotizante. C. paraputrificum también se ha estudiado experimentalmente en codornices gnotobióticas, donde causó lesiones y hemorragias en el revestimiento del intestino asociadas a la enterocolitis.
Además de C. paraputrificum, OTUs altamente significativas que eran más abundantes en los individuos enfermos (Tablas S2-S3) dieron coincidencias de ráfaga (99.5-100% de identidad) con las especies de Clostridium C. colinum, C. cadaveris, C. butyricum y C. perfringens, todas las cuales se han relacionado previamente con la enterocolitis aguda en avestruces y otros animales. Otras OTU que estaban muy sobrerrepresentadas en las muestras de cecal y colon enfermas pertenecían a Enterobacteriaceae, Ruminococcaceae, Mogibacteriaceae, Bacteroides, Dorea, Sedimentibacter, Bilophila wadsworthia y Eggerthella lenta (Fig. 5; Tablas S2-S3). Muchas de estas bacterias forman parte de la microbiota intestinal normal y la mayoría de todas las OTU significativamente sobrerrepresentadas en los individuos enfermos también estaban presentes en algunos individuos de control, aunque en abundancias mucho menores (Tablas S2-S3).
Texas asociadas con la salud en diferentes regiones del intestino
El íleon de los individuos enfermos mostró grandes reducciones en ciertas bacterias en comparación con los controles (Fig. 4), principalmente Bacilli, una clase en la que Turicibacteraceae y Lactobacillaceae fueron las familias más comunes. Turicibacteraceae incluyó dos OTUs significativas de Turicibacter (Tabla S1), que mostraron abundancias reducidas en la ílea enferma. Se ha demostrado que Turicibacter es altamente heredable en humanos y ratones cuando está en contacto directo con las células del huésped del intestino delgado . Este género se ha asociado tanto con la salud como con la enfermedad, pero a menudo se encuentra agotado en animales con diarrea y enteropatía.
Una de las diferencias más llamativas tanto en el ciego como en el colon de los individuos enfermos fue una reducción sustancial de la familia Bacteroidia, S24-7 (Figura S5). Se sabe poco sobre S24-7, a pesar de ser un componente destacado de la microbiota intestinal normal de los vertebrados. Sin embargo, los estudios en ratones han informado de un efecto potencialmente beneficioso de S24-7, cuya abundancia suele reducirse en los huéspedes enfermos. La mayoría de los OTU con abundancias reducidas en el colon de los individuos enfermos también estaban infrarrepresentados en el ciego (15 de 19; 79%), lo que indica un agotamiento a gran escala de bacterias potencialmente asociadas a la salud en todo el intestino posterior. Estas OTU pertenecían a taxones como Lachnospiraceae (p. ej., Coprococcus, Blautia), Ruminococcaceae (p. ej, Ruminococcus), S24-7, Erysipelotrichaceae, Clostridium, Anaeroplasma, Turicibacter, Methanobrevibacter, Akkermansia muciniphila, y varios Clostridiales desconocidos (Fig. 5; Tablas S2-S3).
Mientras que 15 OTUs estaban significativamente sobrerrepresentados en las tres regiones intestinales de los individuos enfermos, sólo un único OTU estaba significativamente subrepresentado en todas las regiones intestinales de los individuos enfermos. Este OTU coincidía con el género productor de butirato Roseburia, que se ha asociado repetidamente con la salud. Por ejemplo, se ha descubierto una menor abundancia de Roseburia spp. en seres humanos con colitis ulcerosa, enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome del intestino irritable, obesidad, encefalopatía hepática y diabetes de tipo 2, y en cerdos con disentería porcina. Estos resultados apoyan la idea de que Roseburia y muchos otros taxones previamente encontrados asociados negativamente con la enfermedad, no sólo son específicos de los patrones de disbiosis de los mamíferos, sino que su agotamiento es una característica unificadora de la disbiosis a través de huéspedes filogenéticamente distantes como los seres humanos y los avestruces.
Disrupción de la microbiota intestinal en las semanas que preceden a la muerte
Para establecer si la disbiosis se produce inmediatamente antes de la muerte o es el resultado de desequilibrios que surgen antes en la vida, examinamos la microbiota de muestras fecales que se recogieron repetidamente antes de la muerte. Encontramos que la supervivencia de los polluelos hasta las 4 semanas de edad no estaba relacionada con la diversidad alfa o filogenética de las bacterias en etapas anteriores de la vida (Tabla S4). Sin embargo, la probabilidad de sobrevivir más allá de las seis semanas se predijo por una mayor diversidad alfa a las 2 semanas de edad (hazard ratio (HR) de Cox: 0,57±0,25, p < 0.05), pero menor diversidad alfa a las 4 semanas de edad (HR: 4,02±0,59, p < 0,05), y menor diversidad filogenética a las dos y cuatro semanas de edad (HR 2 semanas: 1,40±0,15, p < 0,05; HR 4 semanas: 1,88±0,24, p < 0,01) (Figura S6; Tabla S4). Estos resultados sugieren que los individuos con una baja diversidad alfa microbiana a las 2 semanas de edad eran susceptibles de ser colonizados por distintos grupos filogenéticos de bacterias, lo que aumentaba su riesgo de mortalidad en las semanas posteriores.
A continuación, examinamos si las abundancias de las familias bacterianas que diferían entre los individuos enfermos y los de control podían predecir los patrones de mortalidad futura en las semanas previas a la muerte. Sólo hubo pruebas débiles de que tener una mayor abundancia de Lactobacillaceae a las 2 semanas de edad y de Turicibacteraceae a las 4 semanas de edad tenía una tendencia a influir positivamente en la supervivencia (Figura S7; Tabla S4). Las abundancias de Peptostreptococcaceae y S24-7 más allá de las 6 semanas de edad también se asociaron con una mayor supervivencia posterior, aunque no de forma significativa (Tabla S4). Sin embargo, hubo asociaciones muy fuertes entre las abundancias de Peptostreptococcaceae y S24-7 durante la primera semana de vida y la mortalidad en todas las edades posteriores, incluso después de controlar las abundancias de estas familias bacterianas en edades posteriores (rango de HR de Peptostreptococcaceae: 1,65±0,13 a 1,73±0,16, todos los valores de p < 0,001; S24-7 HR range: 1,24±0,11 a 1,60±0,21, todos los valores de p < 0,05) (Fig. 6; Tabla S4). Este resultado sugiere que el momento de la proliferación de ciertos grupos bacterianos, como Peptostreptococcaceae y S24-7, puede ser clave para la aptitud del hospedador, ya que una mayor abundancia durante las edades tempranas puede tener efectos perjudiciales, incluso si los mismos grupos bacterianos pueden ser beneficiosos en edades posteriores. Además, apoya la idea de que el primer par de días después de la eclosión es un período crítico que determina si se producen desequilibrios microbianos, que pueden conducir a un aumento de la mortalidad incluso meses más tarde.
Abundancias (normalizadas y transformadas en logaritmos) de dos familias bacterianas asociadas a la enfermedad en las semanas anteriores a la muerte, medidas mediante muestreos fecales repetidos de los individuos. Los puntos y las barras de error representan las medias ± SE
Fuentes ambientales de las bacterias intestinales
Por último, evaluamos las posibles fuentes ambientales de los microbios presentes en el intestino de los individuos de control y enfermos. Se recogieron muestras de agua, alimentos y sustrato del suelo durante el periodo de estudio y se analizaron con SourceTracker . No hubo esencialmente ninguna contribución del suministro de agua (0,1-0,4%) o del suelo (0,2-0,7%) a la microbiota intestinal de los individuos enfermos o de control (Fig. 7). En cambio, la mayoría de las bacterias intestinales procedían de fuentes desconocidas (89,9%). Algunas secuencias microbianas presentes en los alimentos se solapaban con OTUs encontradas en el íleon y el colon. Sin embargo, éstas se encontraban predominantemente en los individuos de control, lo que puede explicarse porque los individuos sanos comen más que los enfermos (Fig. 7). Estos resultados indican que los alimentos o el agua contaminados eran fuentes poco probables de bacterias asociadas con la mortalidad.
Fuentes ambientales de bacterias presentes en las diferentes secciones del intestino. C = individuos de control y D = individuos enfermos
Nuestro esquema de muestreo ambiental no excluye la posibilidad de que existan otras fuentes ambientales de bacterias patógenas. Por ejemplo, en los recintos exteriores de los polluelos se observaron con frecuencia varias especies de aves silvestres, como gorriones del cabo, tejedores del cabo, tejedores enmascarados, obispos rojos y quelea. El muestreo del agua, la comida y el suelo cada dos semanas también puede no haber sido lo suficientemente frecuente como para detectar la posible presencia transitoria de bacterias en el medio ambiente o los eventos de transmisión que pueden ocurrir esporádicamente. No obstante, nuestros análisis longitudinales del microbioma fecal sugieren que los problemas de disbiosis surgen en las primeras etapas de la vida a partir de los taxones ya presentes en el intestino, en lugar de la adquisición repentina de nuevos taxones. Se sabe poco sobre los microbiomas de los huevos, los padres o el entorno de eclosión de esta especie, pero esta es una vía obvia para futuras investigaciones que pueden ayudar a identificar formas de controlar la prevalencia de bacterias problemáticas durante los primeros años de vida. Para este estudio, los polluelos se criaron aislados de los adultos porque facilita su manejo y manipulación. Sin embargo, este enfoque impide las interacciones entre los polluelos y los padres que pueden ser importantes para el establecimiento temprano de la microbiota intestinal. Por ejemplo, se ha demostrado que la coprofagia (alimentarse de las heces) es importante para el desarrollo de la microbiota en otros animales y se sabe que los polluelos de avestruz son coprófagos. Proporcionar acceso a los adultos (o al menos a sus heces) puede permitir a los polluelos sembrar su microbioma en las primeras etapas de su vida con una comunidad bacteriana equilibrada y diversa, evitando posiblemente la futura proliferación de bacterias problemáticas. Esta idea, sin embargo, está pendiente de ser probada experimentalmente.