Darmdysbiose in der frühen Lebensphase in Verbindung mit juveniler Mortalität bei Straußen

Mortalität und Dysbiose in verschiedenen Darmregionen während der Ontogenese

Die Mortalität juveniler Strauße trat während des gesamten 12-wöchigen Untersuchungszeitraums auf, war aber zwischen 4 und 8 Wochen am höchsten, mit einem Höhepunkt bei 6 Wochen (Abb. 1b). Erkrankte Individuen folgten der Wachstumskurve aller anderen Individuen, bevor sie vor dem Tod schnell an Gewicht verloren (Abb. 1c, d). Die Ursache der Gewichtsabnahme ist nicht bekannt, aber es wurde beobachtet, dass die erkrankten Individuen nicht mehr fraßen und tranken und in einigen Fällen an Durchfall litten, so dass Dehydrierung und Auszehrung eine wahrscheinliche Erklärung sind. Insgesamt starben 40 % aller Küken an einem Krankheitsverdacht (68/170, ohne 60 Kontrollen und 4 verletzte Individuen). Die Obduktion von erkrankten und Kontrollindividuen ergab, dass die Sterblichkeit mit einer ausgedehnten Entzündung des Magen-Darm-Trakts einherging (Abb. 1e; Abb. S1). Die Darmentzündungs-Scores der erkrankten Individuen (Mittelwert ± SD für Ileum = 3,1 ± 1,0, Zökum = 2,0 ± 1,3, Kolon = 2,0 ± 1,2) waren wesentlich höher als die der Kontrollindividuen (Ileum = 0,4 ± 1,0, Zökum = 0.04 ± 0,29, Colon = 0,08 ± 0,45) (Abbildung S1).

Die Struktur der Mikrobiota von erkrankten und Kontrollindividuen war in allen drei Darmregionen extrem unterschiedlich (Abb. 2, Abb. S2, Tabelle 1). Insbesondere gab es signifikante Unterschiede in den mikrobiellen Gemeinschaftsdistanzen (die sowohl mit Bray-Curtis- (BC) als auch mit gewichteten UniFrac- (wUF) Maßen ermittelt wurden) zwischen erkrankten und Kontrollpersonen, wobei Alter, Geschlecht, Gruppe und Zeit seit dem Tod kontrolliert wurden (Tabelle 1). Die Bray-Curtis- und gewichteten UniFrac-Maße zeigten jedoch gegensätzliche Muster: Die Bray-Curtis-Distanzen waren im Ileum am größten und nahmen zum unteren Darm (Zökum-Kolon) hin ab, während die gewichteten UniFrac-Maße im Kolon am größten waren und zum Ileum hin abnahmen (Tabelle 1). Geschlecht, Gruppe und Zeit seit dem Tod hatten keine signifikanten Auswirkungen auf die Abstandsmaße des Mikrobioms in irgendeiner der Darmregionen (Tabelle 1).

Große Unterschiede wurden auch bei der Untersuchung der Variation im Mikrobiom zwischen erkrankten Individuen im Vergleich zur Variation zwischen Kontrollindividuen gefunden. Die erkrankten Individuen waren sich im ilealen Mikrobiom ähnlicher als die Kontrollen untereinander, wenn man Bray-Curtis-, aber nicht gewichtete UniFrac-Distanzen verwendet (BC Multivariater Homogenitätstest der Gruppendispersion (betadisper): F1, 99 = 13,9, p = 0,0003. wUF betadisper: F1, 99 = 0,6, p = 0,46) (Abbildungen S3-S4). Im Gegensatz dazu war das Gegenteil im Zökum und Kolon der Fall (BC cecum betadisper: F1, 105 = 0,08, p = 0,79. BC Colon betadisper: F1, 106 = 1.3, p = 0.25. wUF cecum betadisper: F1, 105 = 11.2, p = 0.001. wUF colon betadisper: F1, 106 = 11,4, p = 0,001) (Abbildung S3). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass sich die bakterielle Zusammensetzung von erkrankten und Kontrollindividuen am stärksten im Ileum unterschied, dass aber das Kolon die phylogenetisch am stärksten unterschiedlichen Gruppen enthielt.

Alpha-Diversität und altersspezifische Dysbiose in verschiedenen Darmregionen

Die mikrobielle Alpha-Diversität von erkrankten Individuen war in allen drei Darmregionen im Vergleich zu Kontrollen stark reduziert (GLMs Krankheit: Ileum F1, 99 = 56,7, p = 2,5e-11; Zökum F1, 105 = 16,1, p = 0,0001; Kolon F1, 106 = 61,5, p = 3,9e-12), wobei das Alter kontrolliert wurde (Abb. 3). Im Ileum blieben die Unterschiede über alle Altersstufen bestehen (GLM Krankheit*Alter: F1, 97 = 0,0001, p = 0,99), und es gab nur geringe Effekte des Alters, selbst bei gesunden Personen (GLM Alter: F1, 98 = 1,4, p = 0,23). Im Zökum und Kolon wiesen erkrankte Individuen in jungen Jahren eine geringere Alpha-Diversität auf als Kontrollen (Tabelle 1; Abb. 3), aber diese Unterschiede nahmen mit dem Alter ab, da die Diversität generell bei allen Individuen zunahm (GLM Krankheit*Alter: Zökum F1, 103 = 10,2, p = 0,002; Kolon F1, 104 = 9,1, p = 0,003). Die Verringerung der Alpha-Diversität, die mit der Krankheit assoziiert ist, war also in frühen Jahren im gesamten Darm zu beobachten, beschränkte sich aber in älteren Jahren auf das Ileum (siehe auch ).

Taxa, die mit der Krankheit im Ileum assoziiert sind

Um die mikrobiellen Unterschiede zwischen erkrankten und Kontrollpersonen besser zu verstehen, haben wir die taxonomische Zusammensetzung aller gastrointestinalen Regionen ausgewertet. Das Ileum zeigte die auffälligsten Hinweise auf eine Dysbiose (Abb. 4). Kontrollindividuen hatten eine vielfältige Gemeinschaft verschiedener Bakterienklassen im Ileum, während erkrankte Individuen eine Blüte von Gammaproteobakterien und eine starke Reduzierung von Bazillen und anderen selteneren Klassen aufwiesen. Eine detaillierte Untersuchung der Familien, die zu den Gammaproteobakterien gehören, zeigte eine fast vollständige Dominanz von Enterobacteriaceae in den erkrankten Ileumproben, während die Kontrollindividuen einen vielfältigen Satz von Gammaproteobakterienfamilien beherbergten (Abbildung S5).

Die gramnegativen Enterobacteriaceae sind eine große Familie, die dafür bekannt ist, dass sie mehrere Darmpathogene und -pathobionten umfassen und häufig in höheren Abundanzen bei Wirten mit Darmdysbiose zu finden sind. Es gab 19 operative taxonomische Einheiten (OTUs; Sequenzen mit 100 % Nukleotididentität), die mit Enterobacteriaceae im Ileum assoziiert waren, und Blast-Suchen gegen die NCBI-Nukleotiddatenbank stimmten mit einer Vielzahl von Gattungen überein, einschließlich Escherichia, Klebsiella, Shigella, Salmonella, Yokenella, Citrobacter, Enterobacter, Cronobacter, Atlantibacter, Pluralibacter, Leclercia und Kluyvera. In früheren Studien wurde gezeigt, dass verschiedene Mitglieder der Enterobacteriaceae-Familie während der Dysbiose oft gleichzeitig auftreten und blühen, was mit unseren Ergebnissen übereinstimmt.

Ein weiteres Hauptmerkmal der Dysbiose im Ileum war, dass bestimmte Individuen Mikrobiome hatten, die fast vollständig aus Clostridien bestanden, ein Muster, das bei keiner Kontrollperson beobachtet wurde (Abbildung 4). Die Familien der Clostridien zeigten weitere auffällige taxonomische Muster bei erkrankten Individuen, einschließlich einer starken Zunahme von Peptostreptococcaceae und einer deutlichen Reduzierung von Ruminococcaceae und anderen seltenen Familien (Abbildung S5). Die Familie Peptostreptococcaceae war in unseren Daten durch sechs OTUs vertreten, und Blast-Suchen ergaben Übereinstimmungen mit verschiedenen Arten von Paeniclostridium, Paraclostridium und Clostridium. Die häufigste dieser OTUs entsprach Paeniclostridium sordellii, einem Bakterium, von dem bekannt ist, dass es virulente Stämme hat, die eine hohe Morbidität und Mortalität durch Enteritis und Enterotoxämie sowohl bei Menschen als auch bei Tieren verursachen.

Als Nächstes identifizierten wir spezifische OTUs, die mit Dysbiose assoziiert sind, indem wir negative binomiale Wald-Tests der bakteriellen Häufigkeiten durchführten, während wir für das Alter der Wirte kontrollierten. Achtunddreißig OTUs waren in der Ilea erkrankter Individuen signifikant überrepräsentiert (Abb. 5), von denen die meisten zu Clostridien gehörten, darunter Ruminococcaceae, verschiedene Clostridium spp, und Epulopiscium, aber auch Bacteroides, Escherichia und Bilophila wadsworthia (Tabelle S1).

Taxa, die mit Krankheiten im Zökum und Kolon assoziiert sind

Die Untersuchung der relativen Häufigkeiten der Bakterienklassen im Zökum und Kolon zeigte, dass die Kontrollindividuen weitgehend ähnlich waren und eine relativ stabile Zusammensetzung des Mikrobioms über Wirte und Alter hinweg aufwiesen. Bei erkrankten Individuen gab es jedoch größere Störungen in der mikrobiellen Zusammensetzung beider Darmregionen (Abb. 4). Ähnlich wie im Ileum waren die Gammaproteobakterien im Zökum und Kolon der erkrankten Individuen stärker vertreten, aber eine Abnahme der Clostridien und eine Zunahme der Bacteroidia stellten die auffälligsten Unterschiede dar. Weitere taxonomische Analysen der Bacteroidia zeigten, dass sich die Familie Porphyromonadaceae im Zökum und Kolon der erkrankten Individuen vermehrt hatte (Abbildung S5). Diese Familie umfasste in unseren Daten zwei Arten, Parabacteroides distasonis und Dysgonomonas sp., die häufig in der normalen Darmmikrobiota zu finden sind. P. distasonis wurde jedoch zuvor als eine Colitis-fördernde Spezies in Mäusen identifiziert, und Dysgonomonas-Mitglieder sind dafür bekannt, mit Kachexie und Darmentzündung in Verbindung gebracht zu werden .

Differenzielle Abundanztests ergaben große Ähnlichkeiten in den Dysbiose-Mustern von Zökum und Kolon, da 50 der 56 (89 %) OTUs, die in den erkrankten Kolonproben häufiger vorkamen, auch in den erkrankten Zökumproben häufiger vorkamen (Abb. 5; Tabellen S2-S3). Darüber hinaus waren 15 dieser OTUs (39 %) auch im Ileum signifikant überrepräsentiert (Tabelle S1). Die signifikanteste OTU im Zökum (q = 1,2e-53) und Kolon (q = 2,4e-56) war bei den Kontrollpersonen nicht vorhanden, aber bei den erkrankten Personen reichlich vorhanden (Tabellen S2-S3). Diese OTU, die auch im Ileum hochsignifikant war (q = 3,4e-21), hatte eine 100%ige Übereinstimmung mit Clostridium paraputrificum, einem bekannten menschlichen Erreger, der mit Sepsis und nekrotisierender Enterokolitis assoziiert ist. C. paraputrificum wurde auch experimentell an gnotobiotischen Wachteln untersucht, wo es Läsionen und Hämorrhagien in der Darmschleimhaut verursachte, die mit Enterokolitis assoziiert waren.

Neben C. paraputrificum zeigten hochsignifikante OTUs, die in kranken Individuen häufiger vorkamen (Tabellen S2-S3), Blast-Matches (99.5-100% Identität) zu den Clostridium-Arten C. colinum, C. cadaveris, C. butyricum und C. perfringens, die alle bereits mit akuter Enterokolitis bei Straußen und anderen Tieren in Verbindung gebracht wurden. Andere OTUs, die in erkrankten Zäkal- und Kolonproben stark überrepräsentiert waren, gehörten zu Enterobacteriaceae, Ruminococcaceae, Mogibacteriaceae, Bacteroides, Dorea, Sedimentibacter, Bilophila wadsworthia und Eggerthella lenta (Abb. 5; Tabellen S2-S3). Viele dieser Bakterien sind Teil der normalen Darmmikrobiota und die Mehrheit aller OTUs, die bei erkrankten Individuen signifikant überrepräsentiert waren, waren auch bei einigen Kontrollindividuen vorhanden, wenn auch in viel geringeren Abundanzen (Tabellen S2-S3).

Taxa, die mit der Gesundheit in verschiedenen Darmregionen assoziiert sind

Das Ileum der erkrankten Individuen zeigte große Reduzierungen bestimmter Bakterien im Vergleich zu den Kontrollen (Abb. 4), hauptsächlich Bacilli, eine Klasse, in der Turicibacteraceae und Lactobacillaceae die häufigsten Familien waren. Zu den Turicibacteraceae gehörten zwei signifikante OTUs von Turicibacter (Tabelle S1), die in erkrankten Ilea verminderte Abundanzen aufwiesen. Turicibacter hat sich bei Menschen und Mäusen, wo es in direktem Kontakt mit Wirtszellen des Dünndarms steht, als hochgradig vererbbar erwiesen. Diese Gattung wurde sowohl mit Gesundheit als auch mit Krankheit in Verbindung gebracht, ist aber oft bei Tieren mit Durchfall und Enteropathie verarmt.

Einer der auffälligsten Unterschiede sowohl im Zökum als auch im Colon der erkrankten Individuen war eine erhebliche Reduzierung der Bacteroidia-Familie, S24-7 (Abbildung S5). Über S24-7 ist nur wenig bekannt, obwohl es ein prominenter Bestandteil der normalen Darmmikrobiota von Wirbeltieren ist. Nichtsdestotrotz haben Studien an Mäusen über einen potenziell positiven Effekt von S24-7 berichtet, wobei die Abundanzen in kranken Wirten oft reduziert sind. Die Mehrheit der OTUs mit reduzierten Abundanzen im Dickdarm von erkrankten Individuen war auch im Zökum unterrepräsentiert (15 von 19; 79 %), was auf eine großflächige Verarmung von potenziell gesundheitsassoziierten Bakterien im gesamten Hinterdarm hinweist. Diese OTUs gehörten zu Taxa wie Lachnospiraceae (z. B. Coprococcus, Blautia), Ruminococcaceae (z. B., Ruminococcus), S24-7, Erysipelotrichaceae, Clostridium, Anaeroplasma, Turicibacter, Methanobrevibacter, Akkermansia muciniphila und mehrere unbekannte Clostridiales (Abb. 5; Tabellen S2-S3).

Während 15 OTUs in allen drei Darmregionen der erkrankten Individuen signifikant überrepräsentiert waren, war nur eine einzige OTU in allen Darmregionen der erkrankten Individuen signifikant unterrepräsentiert. Diese OTU entsprach der Butyrat-produzierenden Gattung Roseburia, die wiederholt mit Gesundheit in Verbindung gebracht wurde. Zum Beispiel wurden geringere Abundanzen von Roseburia spp. bei Menschen mit Colitis ulcerosa, entzündlichen Darmerkrankungen, Reizdarmsyndrom, Fettleibigkeit, hepatischer Enzephalopathie und Typ-2-Diabetes sowie bei Schweinen mit Schweinedysenterie entdeckt. Diese Ergebnisse unterstützen die Idee, dass Roseburia und viele andere Taxa, die zuvor als negativ mit Krankheiten assoziiert gefunden wurden, nicht nur spezifisch für Dysbiose-Muster bei Säugetieren sind, sondern dass ihre Verarmung ein vereinheitlichendes Merkmal der Dysbiose über phylogenetisch entfernte Wirte wie Menschen und Strauße ist.

Unterbrechung der Darm-Mikrobiota in den Wochen vor dem Tod

Um festzustellen, ob die Dysbiose unmittelbar vor dem Tod auftritt oder aus Ungleichgewichten resultiert, die sich früher im Leben entwickeln, haben wir die Mikrobiota von Kotproben untersucht, die wiederholt vor dem Tod gesammelt wurden. Wir fanden heraus, dass das Überleben der Küken bis zu einem Alter von 4 Wochen nicht mit der alpha- oder phylogenetischen Diversität der Bakterien zu einem früheren Zeitpunkt im Leben zusammenhing (Tabelle S4). Allerdings wurde die Wahrscheinlichkeit, über sechs Wochen hinaus zu überleben, durch eine höhere Alpha-Diversität im Alter von 2 Wochen vorhergesagt (Cox’s hazard ratio (HR): 0,57±0,25, p < 0.05), aber eine geringere Alpha-Diversität im Alter von 4 Wochen (HR: 4,02±0,59, p < 0,05) und eine geringere phylogenetische Diversität im Alter von zwei und vier Wochen (HR 2 Wochen: 1.40±0.15, p < 0.05; HR 4 Wochen: 1,88±0,24, p < 0,01) (Abbildung S6; Tabelle S4). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Individuen mit einer geringen mikrobiellen Alpha-Diversität im Alter von 2 Wochen anfällig für eine Besiedlung mit unterschiedlichen phylogenetischen Bakteriengruppen waren, was ihr Sterberisiko in den folgenden Wochen erhöhte.

Als Nächstes untersuchten wir, ob die Häufigkeiten von Bakterienfamilien, die sich zwischen erkrankten und Kontrollindividuen unterschieden, Muster der zukünftigen Sterblichkeit in den Wochen vor dem Tod vorhersagen konnten. Es gab nur schwache Hinweise darauf, dass eine höhere Abundanz von Lactobacillaceae im Alter von 2 Wochen und Turicibacteraceae im Alter von 4 Wochen einen positiven Einfluss auf das Überleben hatte (Abbildung S7; Tabelle S4). Die Abundanzen von Peptostreptococcaceae und S24-7 nach 6 Wochen Alter waren ebenfalls mit einem erhöhten späteren Überleben assoziiert, wenn auch nicht signifikant (Tabelle S4). Es gab jedoch sehr starke Assoziationen zwischen den Abundanzen von Peptostreptococcaceae und S24-7 während der ersten Lebenswoche und der Mortalität in allen nachfolgenden Altersstufen, selbst nach Kontrolle für die Abundanzen dieser Bakterienfamilien in späteren Altersstufen (Peptostreptococcaceae HR range: 1,65±0,13 bis 1,73±0,16, alle p-Werte < 0,001; S24-7 HR-Bereich: 1,24±0,11 bis 1,60±0,21, alle p-Werte < 0,05) (Abb. 6; Tabelle S4). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass der Zeitpunkt der Vermehrung bestimmter Bakteriengruppen, wie z. B. Peptostreptococcaceae und S24-7, für die Fitness des Wirtes entscheidend sein könnte, wobei eine höhere Abundanz in frühen Lebensjahren möglicherweise nachteilige Auswirkungen hat, auch wenn dieselben Bakteriengruppen in späteren Lebensjahren vorteilhaft sein könnten. Dies unterstützt die Vorstellung, dass die ersten paar Tage nach dem Schlüpfen ein kritischer Zeitraum sind, der darüber entscheidet, ob ein mikrobielles Ungleichgewicht entsteht, das auch noch Monate später zu einer erhöhten Sterblichkeit führen kann.

Umweltquellen der Darmbakterien

Schließlich haben wir mögliche Umweltquellen der im Darm von Kontroll- und erkrankten Individuen vorhandenen Mikroben bewertet. Während des Studienzeitraums wurden Proben aus Wasser, Nahrung und Bodensubstrat gesammelt und mit SourceTracker analysiert. Es gab im Wesentlichen keinen Beitrag aus der Wasserversorgung (0,1-0,4 %) oder aus dem Boden (0,2-0,7 %) zur Darmmikrobiota von erkrankten Personen oder Kontrollpersonen (Abb. 7). Stattdessen stammte die Mehrheit der Darmbakterien aus unbekannten Quellen (89,9 %). Einige mikrobielle Sequenzen, die in der Nahrung vorhanden waren, überschnitten sich mit OTUs, die im Ileum und Kolon gefunden wurden. Diese waren jedoch überwiegend bei Kontrollpersonen vorhanden, was dadurch erklärt werden kann, dass gesunde Personen mehr essen als kranke (Abb. 7). Diese Befunde deuten darauf hin, dass kontaminierte Nahrung oder Wasser unwahrscheinliche Quellen der Bakterien waren, die mit der Mortalität in Verbindung gebracht werden.

Unser Schema der Umweltprobennahme schließt nicht aus, dass es andere Umweltquellen für pathogene Bakterien gibt. Zum Beispiel wurden mehrere Arten von Wildvögeln, darunter Kapspatzen, Kapweber, Maskenweber, Rotbauchunken und Weberknechte, häufig in den Außengehegen der Küken beobachtet. Die Beprobung von Wasser, Futter und Boden alle 2 Wochen war möglicherweise auch nicht häufig genug, um eine mögliche vorübergehende Präsenz von Bakterien in der Umgebung oder sporadisch auftretende Übertragungsereignisse zu erkennen. Nichtsdestotrotz deuten unsere Längsschnittanalysen des fäkalen Mikrobioms darauf hin, dass Dysbiose-Probleme früh im Leben durch bereits im Darm vorhandene Taxa entstehen und nicht durch den plötzlichen Erwerb neuer Taxa. Es ist wenig über das Mikrobiom von Eiern, Eltern oder der Schlupfumgebung dieser Spezies bekannt, aber dies ist ein offensichtlicher Weg für zukünftige Forschung, der helfen kann, Wege zur Kontrolle der Prävalenz problematischer Bakterien während des frühen Lebens zu finden. Für diese Studie wurden die Küken isoliert von den erwachsenen Tieren aufgezogen, da dies das Management und die Handhabung erleichtert. Dieser Ansatz verhindert jedoch Interaktionen zwischen Küken und Eltern, die für die frühe Etablierung der Darmmikrobiota wichtig sein könnten. Zum Beispiel hat sich gezeigt, dass Koprophagie (Fressen von Kot) bei anderen Tieren wichtig für die Entwicklung der Mikrobiota ist, und es ist bekannt, dass Straußenküken koprophagisch sind. Der Zugang zu erwachsenen Tieren (oder zumindest zu deren Kot) könnte es den Küken ermöglichen, ihr Mikrobiom schon früh im Leben mit einer ausgewogenen und vielfältigen Bakteriengemeinschaft zu besiedeln und so möglicherweise die zukünftige Vermehrung problematischer Bakterien zu verhindern. Diese Idee muss jedoch noch experimentell getestet werden.